Visualization of specific protein in live system is crucial for understanding biological system, such as clarification of important cellular mechanisms, function of a specific protein, and protein-protein interactions in a living cell. In addition, development of high resolution microscopy such as nanoscopy and super-resolution microscopy (SRM) further promotes the development of protein labeling techniques. To satisfy these needs, a number of protein labeling techniques such as fusing fluorescent protein (FP) or self-labelling enzyme, and tagging using peptide tags or unnatural amino acids were developed. Each technique has its own strong points, but also has some critical limitations. Especially, in case of FP and self-labelling enzyme, because of their relatively big size, it could perturb some protein properties. Hence while devising the labeling techniques with small tagging unit, we focused on the UAA labeling which seemed more potential to selective labeling compared to peptide tags that have high background signal. Also, we chose the SuFEx click chemistry which is remarkably good to be used under physiological condition without interfering biological system and used BODIPY-based probe which is known for its high photostability and quantum yield.
To find the best SuFEx target, we screened several candidates including natural amino acids and analogs with several functional groups by using LC-MS. Among them we found fluorotyrosine is a great SuFEx target which forms high amount of stable adduct even in the presence of free thiols. Also, we found that by adjusting the number and site of fluorides the SuFEx efficiency could be enhanced. Based on these result, we devised the new UAA whose structure has the fluorophenol group linked to Lys. With well-designed target UAA combined with terrific fluorescent sulfonyl fluoride probe, we tried to find an ideal protein labeling technique.
라이브 시스템에서 특정 단백질의 시각화는 세포내 특정 메커니즘의 규명, 단백질의 기능 및 단백질-단백질 상호 작용을 이해하는 데 중요합니다. 이와 더불어 고해상도 현미경의 개발은 단백질 라벨링 기술의 개발을 촉진해왔고, 이에따라 형광 단백질 융합 (FP) 또는 자가-표지화 효소, 펩티드 태그 또는 비천연 아미노산을 사용한 방법 등 다양한 단백질 표지 기술이 개발되어 왔습니다. 각 기술에는 고유한 장점이 있지만 치명적인 단점도 있습니다. 특히, 형광 단백질 및 자가-표지화 효소의 경우, 비교적 큰 크기로 인해 일부 단백질 특성을 변화시킬 수 있습니다. 따라서 작은 태깅 유닛을 이용한 표지 기술을 고안하던 중 펩티드 태그에 비해 배경 신호가 적고 선택적인 표지에 잠재적이라 생각되는 비천연 아미노산을 이용한 표지를 고안했습니다. 또한 생리학적 조건에서 사용하기에 매우 적합한 SuFEx 반응과 배경 신호가 낮은 것으로 잘 알려진 BODIPY 기반 프로브를 사용했습니다. 최상의 SuFEx 표적을 찾기 위해, LC-MS를 사용하여 천연 아미노산 및 유사체를 선별 하였습니다. 그 중에서도 플루오르화 티로신은 빠른 속도로 안정한 결합을 형성하여 훌륭한 SuFEx 표적이라는 것을 발견했습니다. 또한, 플로라이드의 개수 및 위치를 조정함으로써 SuFEx 효율이 향상 될 수 있음을 발견했습니다. 이러한 결과를 바탕으로, 라이신에 연결된 플루오르화 페놀기를 갖는 새로운 비천연 아미노산을 고안 하였습니다. 훌륭한 형광 술포닐 플로라이드 프로브와 잘 설계된 비천연 아미노산을 이용하여 작은 단백질에 대한 이상적인 단백질 표지 기술을 찾으려 노력했습니다.
