The thesis presents a microfilter device for the high-throughput label-free viable isolation of circulating tumor cells (CTCs) and its applications to cancer heterogeneity and exosome research. In spite of the clinical importance of CTCs, the lack of simple and non-biased CTC isolation method is a big hurdle for implementing CTC studies into clinical use. The present microfilter having tapered-slit is designed not only to increase sample flow rate with the minimal captured cell stress but also to isolate CTC selectively, thus achieving high-throughput viable CTC isolation. We verified our device performance for 11 types of cancer cells at the 5 different spiked cancer cell concentrations (5-100 cells/1ml). The present device shows the capture efficiency of 77.7% with the viability of 80.6% at the extremely rare cell (5 cells/ml) and high-throughput (30ml/h) condition. The grafting of poly (ethylene glycol) (PEG) onto the microfilter has been demonstrated for the efficient capture and release of the CTCs. The PEG, a hydrophilic polymeric compound mainly used to form non-fouling thin films on silicon surfaces, generates repulsive force so that the nonspecific adsorption of the surface is incomparably reduced than unmodified filter surfaces. The effectiveness of the PEG-modified filters was verified using lung (H358) and colorectal (SW620) cancer cells spiked in the phosphate-buffered saline (PBS) and the whole bloods. The PEG-modified filters showed approximately 37.7% and 22.8% improvement of release efficiency compared to unmodified filters, without significant changes in cell viability and capture efficiency. Thanks to the device’s heterogeneous viable circulating tumor cell isolation performance, we extended our study to cancer heterogeneity and circulating exosome researches. Using clinical samples from patients with lung, colorectal, breast, pancreatic and renal cell carcinoma, we evaluated the heterogeneity of cancer in terms of CTC’s surface protein expression, cytopathological characteristics, and genetic information. From this study, we showed that CTCs expressed different level of surface protein, cancer associated mRNAs and heterogeneous cytopathological characteristics depending on patient’s pathological characteristic, disease stage, or types of tumor. At the last, we induced the circulating tumor exosomes from the captured viable circulating tumor cells then analyzed both circulating markers to see their similarity and epithelial/mesenchymal properties. The circulating tumor exosomes derived from the CTCs showed the great similarity (80-100%) to CTCs with even higher quantity than CTCs, thus suggesting new way to examine the status of patients using more than one type of circulating markers.
This simple CTC isolation device and experimental setups for cancer heterogeneity and exosome researches can be applicable to comprehensive study of cancer, reflecting its innate heterogeneity and complexity.
본 논문은 고속 비표지 활성유지 혈중암세포 검출을 위한 마이크로 필터 개발기술과 검출된 혈중암세포를 이용한 암 이종성 연구 및 혈중암세포 유래 엑소좀 연구로의 응용을 다룬다. 혈중암세포의 임상학적 중요성에도 불구하고 지난 10여 년 간 간편하면서도 편향되지 않게 혈중암세포를 검출하는 기술은 제한되어 왔으며, 때문에 혈중암세포가 실제 임상에 적용되는 데에는 극히 일부에 지나지 않았다. 본 논문에서 제안하는 감광성폴리머를 기반으로 한 혈중암세포 검출 디바이스는 기존 상용 주사기에 체결함으로써 간편하게 혈중암세포를 선별 또는 회수할 수 있으며 필터 내 경사진 슬릿은 입구가 넓고 출구가 좁은 형태로써, 고속 선별조건에서도 세포가 받는 응력집중을 최소화 하는 것은 물론 세포의 크기와 변형성을 기반으로 선택적인 혈중암세포 선별을 가능하게 한다. 해당 디바이스의 성능을 총 11종의 세포주와 5가지 세포주입농도에서 시험하여 밀리리터 당 5개의 세포 농도와 시간당 3.3밀리리터 처리 유량에서도 77.7% 이상의 혈중암세포를 안정적으로 검출 가능함을 보였다. 해당 마이크로 필터에 폴리에틸렌글리콜의 표면 개질화를 통해 세포의 활성도와 검출성능은 유지하면서도 선별된 혈중암세포의 회수 성능을 폐암세포주와 대장암세포주 실험에서 각각 37.7%, 22.8%를 향상시켰다. 본 소자는 폐, 대장, 유방, 췌장 및 신장암 환자 혈액에 적용함으로써, 암의 종류, 병기, 병리학적 특성에 따라 혈중암세포의 표면단백질 발현 정도, 암 관련 유전자의 mRNA 발현 정도, 세포병리학적 특성이 다르게 나오는 것을 보였으며, 활성유지 선별의 장점을 활용, 혈중암세포에서 직접 유래된 엑소좀을 혈중암세포와 동반분석하여 약 80-100%의 높은 상피/간엽특성의 유사성을 확인하였으며, 기존 혈중 엑소좀과 환자상태간 낮은 연관성으로 인한 엑소좀의 임상적용으로의 어려움을 해결하였다. 5건의 대장암환자시료를 통한 혈중암세포 및 혈중암세포 유래 엑소좀의 동반분석을 통해, 환자가 항암제 반응에 따라 혈중암세포 개수와 함께 상피/간엽성 엑소좀 농도가 비례하게 변화함을 확인하였으며 환자의 질병상태를 진단하는 데 다수의 혈중마커를 함께 이용 가능함을 보였다.
우리는 고속 활성유지 혈중암세포 선별을 위한 본 소자와 엑소좀 연구로의 실험 방법이 향후 암의 이종성과 복잡성을 반영한 종합적인 연구 및 분석에 큰 도움을 줄 것으로 기대한다.
