This thesis presents two different methods for isolating circulating tumor cells (CTCs) with the mass-producible and low-cost polyester fabric sheets: High-throughput viable CTC isolation based on size and deformability and highly-sensitive CTC isolation based on immune-affinity binding on graphene oxide (GO) coating.
CTC isolation method based on size and deformability enables the capture of heterogeneous CTCs, regardless of their surficial protein expressions. Slots with curved walls, which are naturally formed due to the cross-sectional shape of the polyester monofilaments, reduce 21.6% of stress applied to the cells when compared to the conventional slots with straight walls. As a result, 86% of cancer cells remained viable after the isolation process conducted at the flow rate of 25 mL/h. The slots with curved walls also prevent cells from clogging the filter, thus successfully releasing over 92% of the captured cancer cells. We applied our fabric sheets to 11 human blood samples obtained from 9 breast cancer patients and 2 healthy volunteers. The number of CTCs found from patients’ samples was closely related with the expression level of the proliferation marker Ki-67 in the primary tumor. However, the present method resulted in a relatively low CTC capture efficiency of 60-65%.
We have enhanced the CTC capture efficiency by selective increase of cancer cell size. Hypo-osmotic cell swelling increases the size of epithelial-like and mesenchymal-like cancer cells maximum 26% and 16%, respectively, while increasing the size of leukocytes only 9% at the osmolality of 190mOsm/kg. Meanwhile, over 90% of cancer cells remained viable at the given osmolality. Consequently, capture efficiency increased by 9-12% with negligible decrease in specificity and viability. We processed 1mL of 10 human blood samples obtained from 6 colorectal cancer patients and 4 healthy volunteers, in both hypotonic and isotonic conditions. The CTC detection rate and the number of CTCs were increased in hypotonic condition compared to isotonic condition. Therefore, we have demonstrated that the present method is appropriate for the rapid and low-cost cancer diagnosis.
In the immunoaffinity-based CTC isolation, we functionalized the stack of three fabric sheet layers with GO, to increase the density of anti-EpCAM antibodies. The fabric sheet layers with GO modification resulted in CTC capture efficiency of 75-80%, which was 10-25% higher compared to the fabric sheet layers without GO modification. Meanwhile, only 140 leukocytes were captured in 1mL of human blood samples. We performed the clinical study using 10 human blood samples obtained from 7 colorectal cancer patients and 3 healthy volunteers. The GO-coated fabric sheet layers successfully isolated 4-42 CTCs/mL from all cancer patients, while none of the cancerous cells were found in healthy volunteers’ samples. The GO-functionalized fabric sheet layers, capable of highly-sensitive and highly-selective CTC isolation, are feasible for clinical CTC applications.
In summary, we have designed, manufactured, and characterized two different versions of CTC isolation devices made of mass-producible fabric sheets and demonstrated clinical application using human blood samples. The newly developed fabric sheets, producible by well-established and cost-effective textile manufacturing process, result in a simple and novel platform for viable CTC analysis.
본 논문에서는 폴리에스터 모노화이바의 위사와 경사 배열 형태 및 밀도에 따라 슬랏의 간격이 7.6$\mu$m부터 12.1$\mu$m까지 조절 가능한 저가 양산형 천시트를 이용하여 혈중암세포 (Circulating tumor cell, CTC)를 선별 및 회수하는 두 가지 기술을 제시하고자 한다.
먼저, CTC가 다른 혈구세포 대비 크기가 크고 단단하다는 점을 이용하여 선별하는 크기 및 변형성 기반 선별 기술의 경우, 천시트는 화이바가 가지는 원형 단면에 의해 굴곡진 벽면을 가지는 슬랏을 형성하게 되어 기존 수직 단면 필터 대비 선별 시 세포에 가해지는 응력을 21.6% 줄임으로써 25mL/h의 높은 유속조건에서도 86%의 활성도를 유지한 상태로 CTC를 선별할 수 있으며 포획된 CTC를 92%의 높은 회수율로 획득할 수 있다. 1mL의 유방암 환자 혈액 9건 및 정상인 혈액 2건을 대상으로 상기 천시트를 이용하여 선별 실험에 적용한 결과, 정상인 혈액 2건에서는 CTC가 발견되지 않았으나 환자혈액 샘플에서는 모두 CTC가 발견되었으며 개수는 1mL당 최소 1개에서 최대 14개로 나타났다. 검출된 CTC의 개수는 원발암의 진행성과 관련 있는 Ki-67의 수치와 비례하는 경향을 보여 상기 방법은 암의 진행 정도와 전이가능성을 예측하는데 응용될 수 있을 것으로 사료된다.
상기 방법은 민감도가 60-65%로 낮다는 단점이 있어 이를 극복하기 위해 암세포가 활성도를 유지 가능한 190mOsm/kg의 저삼투압 조건에서 혈구세포 대비 크기증가율이 크다는 점을 추가적으로 이용하여 저장액 조건에서 선별실험을 진행하였다. 그 결과, 80% 이상의 활성도를 유지한 상태에서 70-80%의 고민감도로 CTC를 선별할 수 있다.
천시트에 그래핀옥사이드 (Graphene oxide, GO)를 증착 후 Anti-EpCAM 항체를 고정화하여 항원-항체반응을 기반으로 CTC를 선별하는 경우, 3mL/h의 유속조건에서 75-80%의 고민감도로 CTC를 선별 할 수 있을 뿐만 아니라 99.9% 이상의 백혈구를 제거할 수 있어 높은 특이도로 CTC를 획득할 수 있다. 대장암 환자 혈액 7건 및 정상인 혈액 3건을 이용하여 본 소자에 적용한 결과 환자 샘플의 경우 모두 CTC가 검출되었으며 (최소 4개에서 최대27개) 정상인 샘플에서는 모두 CTC가 발견되지 않았다.
저가 양산형 폴리에스터 천시트를 이용한 두 가지의 CTC 선별방법은 추후 암 예후예측 진단, 전이가능성 예측, 및 치료효과 분석 등 다양한 암 관련 임상연구에 적용 가능할 것으로 예측된다.
