Microalgae are considered as an excellent biofuel feedstocks due to their renewable and sustainable nature, and genetic engineering of microalgae are in progress to enhance production of biomass and lipids. In an effort to improve microalgae, glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase (GAPDH) was overexpressed in Chlamydomonas reinhardtii. One transformant, designated PNG, showed increased growth under nitrogen starvation. Interestingly, PNG accumulated more lipids under the same condition compared to wild type. To investigate underlying metabolic mechanisms for the concomitant increase in growth and lipid accumulation, transcriptomic and metabolomic analyses were performed. The multi-omics data consistently pointed to enhanced lipid synthetic pathway and Calvin cycle, while deactivation of starch metabolism in PNG.
To increase more lipid productivity of PNG, we applied a genome editing technique the clustered regularly interspaced short palindromic repeat (CRISPR/Cas9) system. Due to the toxicity of Cas9 and off-target effect, we transiently delivered the Cas9 protein and sgRNAs as the Cas9 RNP. Testing two loci including the MAA7 and CpSRP43 genes, we isolated small indel mutants and NHEJ-mediated knock-in mutants, respectively.
Based on the developed CRISPR/Cas9 system in C. reinhardtii, PNG transformant was transformed with additional Cas9 RNP to knockout the ADP-glucose pyrophosphorylase small subunit (AGPase) gene that is the key enzyme for starch biosynthesis. For better genome editing efficiency, various trials including delivery methods, cell penetrating peptides (CPPs), antisense RNAs of Ku70/80, and high amount of Cas9.
In this study, an improved microalgal strain was isolated by overexpression of GAPDH, which showed concomitant increase in biomass and lipid accumulation. Its metabolic mechanisms were revealed by multi-omics analyses of its metabolome and transcriptome. In addition, successful genome editing technique (CRISPR/Cas9) was demonstrated in the model alga C. reinhardtii, opening exciting possibility for other industrial microalgae for production of biofuels and value-added biomaterials.
화석에너지의 여러 문제점을 해결하기 위해 다양한 대체에너지들에 대한 연구가 진행되었고 미세조류는 광합성 효율이 높고 생장이 빠른 장점으로 인해 유망한 대안으로 떠오르고 있다. 미세조류로부터 바이오디젤의 생산성을 높이는 연구가 활발하게 진행되었고 본 연구에서는 형질전환 방법을 통해 지질 생산성이 우수한 조류주를 개량하고자 하였다.
Glass bead 형질전환 방법을 통해 Glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase (GAPDH)라는 유전자를 과발현하였고, 형질전환체 중 하나를 PNG라고 명명하였다. 질소가 없는 배지 조건에서 배양한 결과, 생장 속도가 빠르면서 지질 함량이 높은 결과를 낳았고 야생형 조류주에 비해 약 3.42 배 지질 생산성이 향상되었다. 다양한 장비를 사용하여 메타볼로믹스와 트랜스크립톰과 같은 멀티-오믹스 분석을 진행하게 되었고 PNG 생체 내 지질 합성 경로를 확인할 수 있었다. 엽록체에서 일어나는 5탄당 인산회로가 활성화되었으며, 녹말이나 셀룰로오즈 등으로 저장되는 경로가 비활성화되면서 다량의 탄소가 지질 축적 경로에 사용될 수 있었다.
생장과 지질이 모두 높아진 형질전환체 PNG 조류주를 추가로 개량하고자, 최신의 유전체 편집 기술인 CRISPR/Cas9를 도입하였다. 정제한 Cas9 단백질과 sgRNA를 미리 활성화시켜 전달하는 Cas9 RNP 방식을 적용하였고 미세조류에서도 해당 기술이 적용가능한지 알아보기 위해 비교적 스크리닝이 용이한 2개의 유전자를 타겟팅해보았다. Auxotrophic 유전자인 MAA7에서는 뉴클레오타이드 변화가 일어난 knockout 돌연변이를, 안테나 복합체 형성에 관여하는 CpSRP43 유전자에서는 NHEJ 방식에 의한 knock-in 돌연변이를 확보함으로써 안정적인 기술을 확립하였다.
확립된 CRISPR/Cas9 기술을 바탕으로 PNG 조류주에 ADP-glucose pyrophosphorylase small subunit (AGPase)라는 유전자 기능을 저하하여 지질 생산성을 더 높이고자 하였다. 유전자 교정 효율을 높이기 위해 Cas9 RNP 전달 방식을 바꾸거나, 셀 침투 펩타이드 처리, Ku70/80 RNA 간섭, Cas9을 과량으로 처리하는 등 다양한 방법을 시도하였다.
본 연구를 통해 바이오디젤 생산에 적합한 이상적인 미세조류를 개량하였고 오믹스 분석을 통해 생체 내에서 지질 축적 메커니즘을 규명하였다. 또한 CRISPR/Cas9이라는 유전체 편집 기술을 미세조류에 적용하여 안정적인 방법을 확립하였고, 유전자 교정 효율을 높이기 위해 다양한 방법을 시도하였다. 실험을 통해 획득한 연구 데이터와 실험 방법은 클라미도모나스 레인하티 뿐만 아니라 다른 미세조류 조류주를 연구하는 모든 이에게 유용하게 사용될 것이라고 생각한다.
