Cytochrome P450 (CYP or P450) belong to a superfamily of multifunctional monooxygenase concerning oxidative metabolism of endogenous or exogenous molecules. P450s can catalyze various regioselective and stereospecific oxidation reactions of non-functionalized hydrocarbons. P450s containing heme molecule as a prosthetic group have been found from most living organisms. Since discovery of P450s in 1958, P450s have been interested from various industrial fields because of its various catalytic activity to large range of substrates. While there are many interests and a lot of researchers have studied about P450s, however, several characteristics have made application of P450s difficult. Briefly, major reasons for limitations of P450s application are dependence on expensive electron donor cofactor (such as NADPH or NADH), additional electron transfer domain (reductase) and heme molecule on their active site. Also, they need to be engineered for industrial uses and enzyme engineering have been difficult. To overcome these limitations, various techniques are even now being developed and some successful cases were reported. In this study, I have focused to improve P450s utilization by following experiments. First, cell surface display of P450s on the E. coli was developed to efficient whole-cell reaction. As P450s were displayed on cell membrane, they could freely use the electron donor and showed normal activity in stable. As a result, it could be free from limitation of NAD(P)H supplying. Furthermore, I changed conventional electron donor to inexpensive eosin Y (EY). In contrast with NAD(P)H, EY has good permeability to cell membrane and could easily penetrate into E. coli. Also, it can directly transfer electrons to active site, thus more efficient whole-cell reaction can be possible without conventional electron donor and reductase. Also, EY-mediated P450 reactions can directly transfer the electron in absence of heme. It means P450 reactions should not be affected by the amount of heme molecule bound to P450s and harsh handling of P450 enzyme for efficient production can be applied. Finally, general high-throughput screening method was developed to enhance the activity or the regioselectivity from wild-type of P450s. This engineering tool was initially designed to be applied regardless of kind of P450s and substrates. Therefore, following experiments should increase the value of P450s in industrial uses.
시토크롬 P450 (cytochrome P450, P450)은 heme을 보조인자로 가지는 효소군으로 대부분의 약물이나 다양한 외인성 물질 및 스테로이드나 지질 등의 내인성 물질에 대한 산화적 대사 작용을 수행하는 효소이다. 생물계에는 대장균을 제외하고는 미생물부터 인간까지 대부분의 생물체가 P450을 가지고 있으며, 인간의 경우 현재까지 약 50 여가지의 P450 유전자가 알려져 있다. P450의 산화반응은 산소분자와 NAD(P)H의 환원물질이 필요하다. 산소분자의 한 원자는 산화되는 기질과 결합하며 다른 한 원자는 물로 환원되다. 다양한 기질들에 대한 P450의 효소 반응들은 화학 반응을 기준으로 carbon hydroxylation, dehydrogenation, dealkylation, epoxydation, Baeyer-Villiger oxidation 등으로 구분될 수 있다.
이러한 다양한 비활성 물질에 대해 활성을 갖는 P450의 효소적 특성에 따라, P450에 대한 쓰임에 대해 관심이 많아지고 연구가 활발히 진행되고 있다. P450의 첫 발견 이래로 이것에 대한 연구는 활발히 진행되고 있지만, 이것의 산업적 활용에는 몇 가지 제약이 있어서 그 활용이 아직까지 쉽지 않다. P450의 활용에 제약이 되는 특징들을 살펴보면, (i) 최초 전자 (electron) 공여인자에 대한 의존도, (ii) 전자를 효소의 활성부위에 전달해줄 추가 단백질 (reductase)의 필요성, (iii) 활성에 있어 heme 분자에 대한 의존도, (iv) 제한적인 야생형의 활성으로 분류할 수 있다. 따라서 본 연구에서는 P450 효소의 산업적 활용에 제약이 되는 것들을 극복할 수 있는 새로운 플랫폼 개발에 중점을 두어 진행되었다.
P450과 같은 효소의 반응은 크게 두 가지로 분류할 수 있다. 세포 배양을 통해 효소를 생산한 뒤에 이것을 정제하여 in vitro 반응으로 진행하는 방법과, 효소의 생산이 완료된 세포 자체를 반응에 이용하는 in vivo 반응이 있다. 후자의 전세포 반응 (whole-cell reaction)의 경우 세포 배양을 마치면 세포의 파쇄 및 효소의 정량 등과 같은 후처리 과정이 생략되기 때문에, 산업적 규모의 대용량 반응을 진행할 경우 상당한 비용 감소의 효과를 볼 수 있다. P450의 경우에는 이것의 활성에 전자를 필요로 하므로 전자를 제공해줄 수 있는 NAD(P)H가 필요한데, 세포 내에는 이것의 양이 절대적으로 부족하여 외부에서 공급해줘야 한다. 하지만, NAD(P)H는 이것의 전하 때문에 새포의 막을 통과하지 못하여 외부에서의 공급에 제한을 받는다. 따라서 본 연구에서는 P450을 세포 표면에 발현하여 전세포 반응을 진행함에 있어 외부로부터 자유롭게 전자를 공급받을 수 있는 시스템을 구축하였다. 이를 위해 B. anthracis의 세포 표면 단백질인 BclA를 P450 BM3 변이체에 도입하였다. P450 BM3의 변이체 유전자에 BclA의 유전자 일부를 도입하여 발현한 결과, 효소가 세포 표면에 발현될 수 있었고 이는 실험적 방법으로 증명되었다. 또한, 표면에 발현된 P450 BM3의 변이체는 큰 단백질 크기 (약 120 kDa)에도 불구하고 온전히 발현되어 실제 전세포 반응에 적용하였을 때, 활성을 유지하는 것을 확인할 수 있었다. 이는 P450의 성공적인 세포 표면 발현의 드문 사례 중 하나이다.
전자 공여인자의 공급 문제를 어느 정도 해결이 되었지만, 궁극적으로는 이것의 의존도는 여전히 P450의 활용에 제약이다. 그 이유는 NAD(P)H의 비싼 가격이다 (1g 기준 약 2,500,000원). 따라서 본 연구에서는 에오신 와이 (eosin Y, EY)라는 물질을 이용하여 전통적인 전자 공여인자를 대체하는 연구를 수행하였다. EY는 본래 세포 등을 염색할 수 있는 염료로 사용되는데, 이것은 빛에 의해 자극을 받으면 TEOA를 산화시키며 전자를 제공할 수 있는 photosensitizer로 활용될 수 있다. 이것은 일단 쉬운 방법으로도 합성이 가능한 물질이기에 가격이 굉장히 싸고 (1g 기준 약 10,000원), 세포 내에도 자유롭게 들어갈 수 있다. 따라서 이것을 P450 반응에 이용한 결과, EY는 P450에 특이적으로 결합하여 빛에 의해 자극받을 때 전자를 제공하는 것을 확인하였다. 또한, 제공되는 전자는 reductase를 거치지 않고 곧바로 P450의 활성부위로 전해지는 것도 확인하였다. 그 결과, EY를 통해 기존의 값비싼 전자 공여인자를 대체함은 물론 P450의 발현에 항상 동반되어야할 reductase의 필요성이 없어졌다. 또 EY는 세포내에 자유롭게 들어갈 수 있으므로, 전세포 반응으로 효소 반응을 진행할 수 있기 때문에 이 방법은 기존의 방법에 비해 상당한 비용적 감소 효과를 기대할 수 있게 되었다.
앞선 EY 기반의 보조인자 및 reductase의 비의존적인 P450의 반응을 심화 연구하기 위해, EY에 의한 전자 전달의 흐름을 파악하는데 중점을 두었다. 따라서 이어 진행되었던 연구에서는 EY를 이용한 반응으로 P450의 heme이 필요하지 않은 반응 플랫폼을 구축할 수 있었다. 빛과 EY에 의한 P450의 반응은 본래 전자가 P450의 heme 분자에 전해지면서 활성을 갖는 것인데, heme 분자가 없을 경우에는 전자가 전달되는 것을 확인할 수 있었다. 이는 EY의 화학적 특성에 기인하는데, 빛에 의해 자극을 받은 EY는 그 자체로 산화 또는 환원될 수 있는 상태가 되어 전자를 전달할 수 있는 상태가 된다. P450에 heme 분자가 있을 때에는 heme에 전자를 전달하지만, heme이 없을 경우에는 P450에 의해 제공받는 기질의 활성부위에 반응을 진행할 수 있는 상태가 된다. EY를 이용한 P450의 반응이 heme에 무관하게 진행됨에 따라 P450의 생산에 필요한 heme 전구체 (1g 기준 약 350,000원)가 더 이상 필요하지 않고, P450 생산 후에 후처리 과정 중 heme이 P450에서 분리되는 것을 더 이상 관여하지 않고 실험을 진행할 수 있게 되어 P450의 활용에 큰 도움이 될 것이다.
마지막으로, 야생형의 P450이 갖는 제한적인 활성을 극복할 수 있는 유세포 분리기 (Fluorescence-activated cell sorter, FACS) 기반의 P450의 초고속 탐색 (high-throughput screening) 시스템을 구축하였다. 이를 위해 P450의 효소 반응에 따라 형광 단백질을 생산할 수 있는 유전자 회로 (genetic circuit)를 구축하였고, 1차적으로 이것의 최적화를 위한 초고속 탐색을 진행하였다. 그 결과, P450의 초고속 탐색에 적합하도록 유전자 회로가 개량되었고, 개량된 유전자 회로를 바탕으로 P450의 초고속 탐색을 2차적으로 진행하였다. 최종적으로 얻어진 P450의 변형체들은 초고속 탐색에 대상 기질로 사용되었던 omeprazole이라는 약물에 대해 기존 야생형 P450이 갖는 활성보다 최대 10배 정도 증가하는 것을 확인하였다. 이는 P450의 활성 증가를 위한 최초의 유세포 분리기 기반의 초고속 탐색의 성공사례이다. 본 연구에서 P450의 초고속 탐색에 이용할 수 있도록 개발된 시스템은 이론적으로 모든 P450의 반응에 기반을 두기 때문에 다양한 P450의 활성을 증가시킬 수 있는 방법으로 그 쓰임이 유용할 것으로 기대되고 있다.
언급된 일련의 실험들을 통해 본 연구에서는 비로소 최초 P450의 산업적 활용에 제한이 되는 요소인 전자 공여 보조인자 문제, 활성을 위한 부가적인 단백질 및 heme 분자에 대한 의존 문제 그리고 제한적인 활성에 대한 문제들을 극복할 수 있는 새로운 플랫폼들의 개발에 성공하였다. 이 연구를 바탕으로 최근까지 계속 관심이 증가하고 있는 P450의 활용에 대한 대안으로 사용되기 기대된다. 이러한 다양한 비활성 물질에 대해 활성을 갖는 P450의 효소적 특성에 따라, P450에 대한 쓰임에 대해 관심이 많아지고 연구가 활발히 진행되고 있다. P450의 첫 발견 이래로 이것에 대한 연구는 활발히 진행되고 있지만, 이것의 산업적 활용에는 몇 가지 제약이 있어서 그 활용이 아직까지 쉽지 않다. P450의 활용에 제약이 되는 특징들을 살펴보면, (i) 최초 전자 (electron) 공여인자에 대한 의존도, (ii) 전자를 효소의 활성부위에 전달해줄 추가 단백질 (reductase)의 필요성, (iii) 활성에 있어 heme 분자에 대한 의존도, (iv) 제한적인 야생형의 활성으로 분류할 수 있다. 따라서 본 연구에서는 P450 효소의 산업적 활용에 제약이 되는 것들을 극복할 수 있는 새로운 플랫폼 개발에 중점을 두어 진행되었다. 이를 위해 본 연구에서 진행한 실험들에 대하여 간략히 요약한다. P450과 같은 효소의 반응은 크게 두 가지로 분류할 수 있다. 세포 배양을 통해 효소를 생산한 뒤에 이것을 정제하여 in vitro 반응으로 진행하는 방법과, 효소의 생산이 완료된 세포 자체를 반응에 이용하는 in vivo 반응이 있다. 후자의 전세포 반응 (whole-cell reaction)의 경우 세포 배양을 마치면 세포의 파쇄 및 효소의 정량 등과 같은 후처리 과정이 생략되기 때문에, 산업적 규모의 대용량 반응을 진행할 경우 상당한 비용 감소의 효과를 볼 수 있다. P450의 경우에는 이것의 활성에 전자를 필요로 하므로 전자를 제공해줄 수 있는 NAD(P)H가 필요한데, 세포 내에는 이것의 양이 절대적으로 부족하여 외부에서 공급해줘야 한다. 하지만, NAD(P)H는 이것의 전하 때문에 새포의 막을 통과하지 못하여 외부에서의 공급에 제한을 받는다. 따라서 본 연구의 ‘Chapter 2’에서는 P450을 세포 표면에 발현하여 전세포 반응을 진행함에 있어 외부로부터 자유롭게 전자를 공급받을 수 있는 시스템을 구축하였다. 이를 위해 B. anthracis의 세포 표면 단백질인 BclA를 P450 BM3 변이체에 도입하였다. P450 BM3의 변이체 유전자에 BclA의 유전자 일부를 도입하여 발현한 결과, 효소가 세포 표면에 발현될 수 있었고 이는 실험적 방법으로 증명되었다. 또한, 표면에 발현된 P450 BM3의 변이체는 큰 단백질 크기 (약 120 kDa)에도 불구하고 온전히 발현되어 실제 전세포 반응에 적용하였을 때, 활성을 유지하는 것을 확인할 수 있었다. 이는 P450의 성공적인 세포 표면 발현의 드문 사례 중 하나이다. 전자 공여인자의 공급 문제를 어느 정도 해결이 되었지만, 궁극적으로는 이것의 의존도는 여전히 P450의 활용에 제약이다. 그 이유는 NAD(P)H의 비싼 가격이다 (1g 기준 약 2,500,000원). 따라서 본 연구의 ‘Chapter 3’에서는 에오신 와이 (eosin Y, EY)라는 물질을 이용하여 전통적인 전자 공여인자를 대체하는 연구를 수행하였다. EY는 본래 세포 등을 염색할 수 있는 염료로 사용되는데, 이것은 빛에 의해 자극을 받으면 TEOA를 산화시키며 전자를 제공할 수 있는 photosensitizer로 활용될 수 있다. 이것은 일단 쉬운 방법으로도 합성이 가능한 물질이기에 가격이 굉장히 싸고 (1g 기준 약 10,000원), 세포 내에도 자유롭게 들어갈 수 있다. 따라서 이것을 P450 반응에 이용한 결과, EY는 P450에 특이적으로 결합하여 빛에 의해 자극받을 때 전자를 제공하는 것을 확인하였다. 또한, 제공되는 전자는 reductase를 거치지 않고 곧바로 P450의 활성부위로 전해지는 것도 확인하였다. 그 결과, EY를 통해 기존의 값비싼 전자 공여인자를 대체함은 물론 P450의 발현에 항상 동반되어야할 reductase의 필요성이 없어졌다. 또 EY는 세포내에 자유롭게 들어갈 수 있으므로, 전세포 반응으로 효소 반응을 진행할 수 있기 때문에 이 방법은 기존의 방법에 비해 상당한 비용적 감소 효과를 기대할 수 있게 되었다. 앞선 EY 기반의 보조인자 및 reductase의 비의존적인 P450의 반응을 심화 연구하기 위해, EY에 의한 전자 전달의 흐름을 파악하는데 중점을 두었다. 따라서 이어 진행되었던 ‘Chapter 4’에서는 EY를 이용한 반응으로 P450의 heme이 필요하지 않은 반응 플랫폼을 구축할 수 있었다. 빛과 EY에 의한 P450의 반응은 본래 전자가 P450의 heme 분자에 전해지면서 활성을 갖는 것인데, heme 분자가 없을 경우에는 전자가 전달되는 것을 확인할 수 있었다. 이는 EY의 화학적 특성에 기인하는데, 빛에 의해 자극을 받은 EY는 그 자체로 산화 또는 환원될 수 있는 상태가 되어 전자를 전달할 수 있는 상태가 된다. P450에 heme 분자가 있을 때에는 heme에 전자를 전달하지만, heme이 없을 경우에는 P450에 의해 제공받는 기질의 활성부위에 반응을 진행할 수 있는 상태가 된다. EY를 이용한 P450의 반응이 heme에 무관하게 진행됨에 따라 P450의 생산에 필요한 heme 전구체 (1g 기준 약 350,000원)가 더 이상 필요하지 않고, P450 생산 후에 후처리 과정 중 heme이 P450에서 분리되는 것을 더 이상 관여하지 않고 실험을 진행할 수 있게 되어 P450의 활용에 큰 도움이 될 것이다. 마지막으로, ‘Chapter 5’에서는 야생형 (wild type)의 P450이 갖는 제한적인 활성을 극복할 수 있는 유세포 분리기 (Fluorescence-activated cell sorter, FACS) 기반의 P450의 초고속 탐색 (high-throughput screening) 시스템을 구축하였다. 이를 위해 P450의 효소 반응에 따라 형광 단백질을 생산할 수 있는 유전자 회로 (genetic circuit)를 구축하였고, 1차적으로 이것의 최적화를 위한 초고속 탐색을 진행하였다. 그 결과, P450의 초고속 탐색에 적합하도록 유전자 회로가 개량되었고, 개량된 유전자 회로를 바탕으로 P450의 초고속 탐색을 2차적으로 진행하였다. 최종적으로 얻어진 P450의 변형체들은 초고속 탐색에 대상 기질로 사용되었던 omeprazole이라는 약물에 대해 기존 야생형 P450이 갖는 활성보다 최대 10배 정도 증가하는 것을 확인하였다. 이는 P450의 활성 증가를 위한 최초의 유세포 분리기 기반의 초고속 탐색의 성공사례이다. 본 연구에서 P450의 초고속 탐색에 이용할 수 있도록 개발된 시스템은 이론적으로 모든 P450의 반응에 기반을 두기 때문에 다양한 P450의 활성을 증가시킬 수 있는 방법으로 그 쓰임이 유용할 것으로 기대되고 있다. 언급된 일련의 실험들을 통해 본 연구에서는 비로소 최초 P450의 산업적 활용에 제한이 되는 요소인 전자 공여 보조인자 문제, 활성을 위한 부가적인 단백질 및 heme 분자에 대한 의존 문제 그리고 제한적인 활성에 대한 문제들을 극복할 수 있는 새로운 플랫폼들의 개발에 성공하였다. 이 연구를 바탕으로 최근까지 계속 관심이 증가하고 있는 P450의 활용에 대한 대안으로 사용되기 기대된다.
