The aim of this study was to explore whether polymorphisms in TFAM gene are associated with Korean GC patient and discover the novel role of TFAM in GC. The genotypes of 2147 Korean participants (including 548 IGC and 393 DGC GC patients) were examined for 9 tag single-nucleotide polymorphisms (SNPs). Susceptibility to diffuse-type GC was strongly and significantly associated with several SNPs including rs10826175 (A>G) in the intergenic region (GG+GA versus AA, odds ratio = 1.396 P = 0.019) and rs1937 (G>C) in exon 1 (CC+GC versus GG, odds ratio = 1.287, P = 0.044). To validate the GC association with TFAM and how TFAM functions in GC, we silenced TFAM using siRNA and shRNA in GC cell lines. Downregulation of TFAM by siRNA changed cell morphology, decreased cell proliferation, and inhibit cell migration and invasion in MKN45 (diffuse type GC cell line). In order to gain insights of how these phenotype is influenced by TFAM downstream genes, RNA sequencing (RNA-seq) was performed. Differentially expressed genes (DEG) analysis was performed with scrambled siRNA treated control samples and TFAM knockdown samples. Finally, 101 genes were selected. Among 101 DEGs, 68 genes, which have gene information, Quantitative Real time PCR (qPCR) was performed to validate the expression level. Finally, top 10 genes were selected with following criteria: qPCR p-value> 0.05 at 6 h dataset, qPCR p-value <0.05 and FC> 3 at 24 h dataset. Among top 10 DEGs, when CCDC108 and PCK1 expression were rescued in TFAM knockdown phenotype in MKN45. When both genes were rescued respectively, it alleviates the phenotypic effects of TFAM knockdown in cell proliferation and morphological change of MKN45. Among TFAM downstream genes that may be responsible for functional role in promoting cancer cell growth and invasion, TFAM-CCDC108-PCK1 may play pivotal roles in GC.
세계적으로 위암 발생률이 줄어 들고 있지만 여전히 4번째로 많이 발생하는 암 종류이고 2번째로 치사율이 높은 암으로 분류된다. 2013년 국가암등록 통계에 의하면 국내에서는 2번째로 많이 발생하는 암으로 분석되었고 국내 남자 암 발생률에서는 위암이 제일 높은 것으로 알려져 있다. 위암을 유발하는 정확한 기작은 알려져 있지 않지만 여러 유전자들과 환경적인 요소들의 복합적인 상호작용을 통한 것으로 보고 되었다. 따라서 아직까지 알려져 있지 않은 위암 발생과 과정에 기여하는 유전적인 요소를 밝히는 것은 발병 기작과 치료 타겟 발굴을 위해 필수적이다.
이번 연구에서는 위암 연관 유전변이 발굴에 매우 유요한 단일 염기 다형성 (Single nucleotide polymorphism; SNP)을 이용한 환자군-대조군 연관 연구방법을 통해 위암과 연관된 유전변이와 유전자를 발견하였다. 활력체 전사인자 A(TFAM)은 위암의 잠재적인 후보 유전 구역인 Chromosome 10: 58,385,022-58,399,221에 위치하며, 위암 환자에서 유전자 발현 양이 증가하는 것으로 분석되었다. 또한 위암 조직과 정상 조직을 비교했을 때 TFAM의 발현 양이 위암 조직에서 더 높은 것으로 분석이 되어 TFAM이 위암 유발인자 및 진행 과정에 중요한 역할을 하는 인자로 해석이 된다. TFAM 유전자와 위암의 연관성을 규명하기 위해 TFAM 주변 구역에서 9개의 tag SNP가 선택 되었으며, 941 명의 위암 환자와 1206명의 대조군에서 유전형 분석을 실시하였다. 그 결과 rs10826175 와 rs1937이 독립적으로 위암과 연관성을 나타내었다.
위암과 연관된 유전변이 및 유전자 역할을 확인하기 위해 11개의 위암세포주에서 TFAM 발현 양이 가장 높은 MKN45를 사용하여 위암 기능연구를 시행하였다. TFAM을 억제 시킨 MKN45세포에서 암 세포 증식이 감소 할 뿐 아니라 세포의 모양도 변하고 세포 증식 패턴이 변하는 것을 관찰 할 수 있었다. TFAM 유전자가 위암 전이와 연관이 있는지 확인 하기 위해 transwell을 사용하여 세포 이동과 침윤을 측정 하였다. 흥미롭게도 TFAM이 억제 되어있을 때 세포의 이동과 침윤 모두 감소하는 결과를 얻을 수 있었다.
TFAM 유전자 억제를 통해 암세포 기능이 감소하는 것을 관찰 하였고 TFAM 하위 유전자 발현 변화에 의해 어떻게 암세포 기능이 억제되었는지 분석하고자 하였다. 먼저 TFAM 하위 유전자들을 찾기 위해 TFAM이 억제된 MKN45 세포 전체의 RNA 발현 변화를 RNA-seq 기법을 통해 측정하여 TFAM 하위 유전자들을 선별하였다. RNA-seq 결과를 통계적으로 분석하여 총 68개의 후보 유전자들을 선별 하였고 유전자 발현 변화를 qPCR로 검증하여 총 10개의 최종 후보 유전자들을 선별 하였다. 10개의 후보 유전자중 4개의 유전자는 TFAM이 억제된 MKN45에서 과발현 되어있는 것으로 분석이 되었고 6개의 유전자는 저발현 되어있는 것으로 분석되었다. 10개 최종 후보 유전자들이 어떻게 위암세포 기능에 연관 되어있는지 증명하기 위해 유전자들의 발현을 변화시켜 위암 세포 기능 연구를 실시하였다. 결과적으로 CCDC108과 PCK1 발현이 TFAM 발현을 억제 한 MKN45 세포에서 발현 양이 크게 증가 되어있었고 CCDC108과 PCK1의 유전자를 다시 억제 시켰을 때 세포증식과 세포 모양이 다시 원래 상태로 되돌아 가는 현상을 발견 하였다. CCDC108과 PCK1은 TFAM 하위 유전자로 기능을 하고 MKN45의 세포증식과 세포 모양 변화에 중요한 역할을 한다는 사실을 증명 하였다. 또한 TFAM을 억제 하였을 때 활력체 기능이 비활성화 됨으로 칼슘과 ROS 농도가 세포 내에서 높아지는 현상을 발견 하였는데 세포 내 칼슘농도가 CCDC108과 PCK1 유전자 발현을 크게 증가 시키는 것을 증명 하였다. 또한 나머지 8개의 유전자중 ITPK1, GLRX5, BAK1, MRPS33, NCAPG2, RAN 유전자들은 TFAM을 억제시 저발현 되어있는 것으로 분석이 되었는데 이 유전자들을 siRNA를 처리하여 각각 발현을 억제 시켰을 때 모두 세포 증식을 억제하는 것으로 관찰 되었다.
본 연구를 통하여 TFAM이 위암에 감수성을 가지고 암 촉진 기능을 가진다는 것을 밝히게 되었다. 또한 CCDC108과 PCK1이 TFAM 하위 유전자로 조절되면서 암 촉진 기능에 관여하고 있다는 사실을 알아낸 것이 가장 큰 의미 있는 발견이었다. 이 연구 결과를 통해 위암에 걸릴 확률이 높은 사람들이 사전에 예방할 수 있게 도와주고, 이미 암에 걸린 사람들에게는 보다 효율 적인 치료를 제공할 수 있는 기반을 제공하는 데에 공헌하기를 기대한다.
