Nannochloropsis salina, a marine alga with high growth rate and lipid composition has been considered to be one of the most appropriate species for the feed stock of biofuels or value-added products. In this research, for the purpose of increasing the overall lipid production rate of N. salina, genetic engineering was adopted to enhance the photosynthetic efficiency and lipid biosynthesis metabolism within the strain. To improve the photosynthetic efficiency, new kinds of light harvesting pigments were heterogeneously synthesized to broaden the light spectrum that N. salina can utilize. For this, a vector system that can deliver the expressed protein to the complex chloroplast of the heterokonts were developed, which were then used to express chlorophyllide a oxygenase (CAO) gene and chlorophyll f synthase (ChlF) gene from Chlamydomonas reinhardtii and Chlorogloeopsis fritschii respectively, after optimizing the sequence for N. salina. As a result, transformants with chlorophyll b and f synthesis could be achieved for the first time in N. salina. Transformants with Chlb showed an improved photosynthetic efficiency under low to high light conditions. The additional energy synthesized from the photosynthetic improvements were used for growth under moderate light conditions (90 uE) whereas the energy was used for lipid synthesis under high light condition (200 uE). However, transformants with Chlf did not grow well and lost the ChlF functions within 2 months, implying toxic effects of Chlf in N. salina.
Furthermore, in order to increase the portion of carbon flux that enters the lipid synthesis pathway, key metabolic enzymes for lipid bio-synthesis were overexpressed in a wild type N. salina. For this, two genes, each encoding Glycerol-3-phosphate dehydrogenase(GPDH) and Phospholipid: diacylglycerol acyltransferase(PDAT) that are responsible for the reaction of first and last reactions for TAG synthesis were selected. The transformants with overexpressed NsGPDH and NsPDAT enzyme showed a tendency of hampered proliferation but the change was not significant. However, the lipid accumulation in each transformants showed up to 40 % increase compared to the wild type. To assure its possibility for producing biodiesel, FAME contents of each transformants were also analyzed and an increase of FAME productivity by up to 40 % were observed in the transformants.
After confirming the beneficial effects of chlorophyll b and GPDH/PDAT in photosynthesis and lipid biosynthesis pathways, multigene expression system in N. salina was developed to provide a tool for co-expression. For this, four kinds of 2A self-cleaving peptides in N. salina was tested and E2A turned out to be the best performer in the strain. It is expected that the study on expression of CAO, GPDH, and PDAT genes along with the development of multigene expression system in N. salina will be beneficial for industrial uses and further research in this field.
해양 미세조류인 나노클로롭시스는 높은 생장량과 지질함량을 바탕으로, 바이오연료 및 고부가가치 산물을 생산하기에 최적의 종 중 하나로 평가받고 있다. 본 연구는 나노클로롭시스 종의 광합성 효율을 개선하고 지질대사경로상의 신진대사를 촉진시켜, 총 지질 생산량을 증가시키고자 하는 목적으로 진행되었다. 광합성 효율을 향상시키는 방안으로 나노클로롭시스가 기존에 가지고 있지 않은 광합성 색소를 발현시키고자 하였고, 이를 통해 더 넓은 파장대의 빛을 활용할 수 있도록 유도하였다. 소기의 목적을 위해 4중막의 복잡한 특수 구조를 지닌 나노클로롭시스의 엽록체까지 단백질이 도달할 수 있도록 하는 벡터를 제작하였으며, 녹조류인 클라미도모나스 레인하티 유래 ‘엽록소 비’ 생산 단백질 및 시아노박테리아 유래의 ‘엽록소 에프’ 생산 단백질을 나노클로롭시스에서 발현시키는데 성공하였다. 엽록소 에프의 경우, 색소의 생성까지 확인은 하였으나, 그 발현이 안정적이지 못하고 생장에 큰 도움을 주지 못한 것으로 보였다. 반면 엽록소 비의 발현은 전반적인 광합성 효율을 약 30%까지 증가시킬 수 있었고, 이렇게 추가적으로 생산된 에너지는 약한 빛 환경에서는 주로 생장에, 강한 빛 조건에서는 지질 생산에 활용되는 것을 확인하였다.
나아가, 미세조류에서 지질 합성에 사용되는 에너지의 비율을 더욱 높이기 위하여, 지질대사경로인 케네디패스웨이의 처음과 마지막에 관여하는 효소인 글리세롤-3-포스페이트디하이드로제네이스와 포스포리피드:다이아실글리세롤 아실트랜스퍼레이스 생산 유전자를 나노클로롭시스 종에서 각각 확인하고, 과발현 시키는 실험을 진행하였다. 각각의 유전자가 발현된 형질전환체들은 생장에 있어 약간의 감소하는 경향을 보였지만, 지질 함량은 두 경우 모두 약 40%까지 증가하여 총 지질 생산량 30% 이상 증가한 것을 확인하였다. 추가적인 분석을 통해 각각의 형질전환체에서 증가된 지질의 조성 및 지방산메틸에스테르로 전환시의 성분비를 비교하였고, 실제 바이오 연료로 활용될 가능성을 검증하였다.
이렇게 광합성효율과 지질 생산량이 각각 증진된 종들을 분석하고 난 후, 광합성 효율과 지질 합성 능력이 동시에 증진된 종의 제작을 위하여 나노클로롭시스 살리나에 최적화된 다유전자 발현 시스템을 개발하였다. 본 연구에서 개발한 나노클로롭시스 종의 다유전자 발현 시스템 및 광합성/지질 생산을 향상시킨 형질전환 연구는 앞으로 나노클로롭시스의 산업적 활용에 있어 큰 도움이 되리라 생각한다.
