As patents for biopharmaceuticals that have been in use for decades have expired, many pharmaceutical companies are developing biosimilars. Biosimilars should be comprehensively evaluated by applying various analytical techniques for the similarities and differences with the reference product. In particular, since therapeutic glycoproteins have very complicated structure, dozens of analytical methods should be developed and applied to develop a single biosimilar product. The therapeutic glycoprotein characterization consists of physicochemical characterization to analyze primary structure, glycosylation, physicochemical properties (electrophoresis, chromatographic, spectroscopic characteristics) and immunochemical properties, and biological characterization. Individual analytical methods should be developed as sensitive and reproducible methods based on sound scientific principles.The results of characterization study using these analytical methods can be complementary and consistent with each other in order to comprehensively show the characteristics of therapeutic glycoprotein. In this study, N-glycan analytical method to evaluate the most important quality attribute of therapeutic glycoprotein was developed and a comprehensive characterization study to compare the proposed biosimilar, LBDE with reference product, $NESP^®$ was performed.
N-glycans of therapeutic glycoproteins are critical quality attributes that should be monitored throughout all stages of biopharmaceutical development and manufacturing life cycle in industry. To reduce the time for sample preparation and variations in analytical results, we developed the N-glycan analysis method including improved 2-aminobenzoic acid (2-AA) labeling. Using this analytical method, 15 major 2-AA labeled N-glycans of $Enbrel^®$ were separated into single peaks in hydrophilic interaction chromatography mode and therefore could be quantitated. 2-AA labeled N-glycans were also highly compatible with in-line quadrupole time-of-flight mass spectrometry (Q-TOF MS) for the structural identification. The structures of 15 major and 18 minor N-glycans were identified from their mass values determined by Q-TOF MS. Furthermore, the structures of 14 major N-glycans were confirmed by interpreting the MS/MS data of each N-glycan. This analytical method was also successfully applied to neutral N-glycans of $Humira^®$ and highly sialylated N-glycans of $NESP^®$. Furthermore, the analysis data of $Enbrel^®$ that were accumulated for 2.5 years demonstrated high-level consistency of this analytical method. Taken together, a wide repertoire of N-glycans of therapeutic glycoproteins can be analyzed with high efficiency and consistency using improved 2-AA labeling based N-glycan analysis method.
For regulatory approval, the comparability of a biosimilar product to an originator product should be ensured through thorough physicochemical and biological characterization.To evaluate the biosimilarity between LBDE, the proposed biosimilar darbepoetin alfa, and $NESP^®$, its originator, we performed a comprehensive physicochemical and biological characterization study.Primary and higher-order protein structures were analyzed using Lys-C peptide mapping with liquid chromatography-mass spectrometry (LC-MS), disulfide bond identification, circular dichroism, and fluorescence spectroscopy. Glycosylation and isoform distribution were analyzed using MS, LC, and capillary zone electrophoresis. Size variants were evaluated with size-exclusion chromatography-high-performance liquid chromatography (SEC-HPLC) and sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE). Biological characterization included binding affinity for human erythropoietin receptor, in vitro cell proliferation, and in vivo potency. Pharmacokinetics (PK) was evaluated using rats through two injection routes.Non-reducing and reducing Lys-C peptide mapping showed a highly similar peak profile, confirming that LBDE and $NESP^®$ have the same primary structure and disulfide bonds. Glycosylation and isoform analyses showed that the attached N-glycan and O-glycan structures were the same and their relative contents were similar. Spectroscopic analysis of LBDE showed indistinguishable spectra with $NESP^®$. For both LBDE and $NESP^®$, a very small amount of size variants was found in SEC-HPLC, and no minor bands were detected in SDS-PAGE. Furthermore, LBDE did not show any difference with $NESP^®$ in the binding affinity for human erythropoietin receptor, in vitro cell proliferation, and in vivo potency. PK parameters of LBDE were in good agreement with those of $NESP^®$.LBDE shows high similarity to $NESP^®$with regard to structure and function.
In conclusion, N-glycan analysis method based on improved 2-aminobenzoic acid labeling was successfully developed and optimized for three therapeutic glycoproteins ($Enbrel^®$, $Humira^®$ and $NESP^®$). 20 physicochemical characterization and 4 biological characterization methods were developed and applied to fully understand and compare the quality attributes of proposed biosimilar, LBDE and reference product, $NESP^®$. And LBDE showed high similarity with $NESP^®$.
지난 수십년동안 사용되던 단백질 의약품의 특허가 만료됨에 따라 많은 제약회사들이 바이오시밀러 개발을 진행하고 있다. 바이오시밀러는 대조약과의 동등성과 차이점을 다양한 분석 기술을 적용하여 종합적으로 평가해야 한다. 특히, 당단백질 의약품의 경우 매우 복잡한 구조를 가지고 있기 때문에, 하나의 제품에 대하여 수십 가지의 분석법을 개발하여 적용해야 한다. 당단백질 의약품의 특성분석은 일차구조, 당화, 물리화학적 특성 (전기영동, 크로마토그래픽, 분광학적 특성) 그리고 면역화학적 특성등을 분석하는 물리화학적 특성분석과 생물학적 특성분석으로 구성되어 있다. 개별 분석법은 과학적 원리를 기반으로 민감하고 재현성 높은 분석법으로 개발되어 적용되어야 한다. 이러한 분석법들로 이루어진 특성분석에서 얻은 결과는 당단백질의 특성을 종합적으로 보여줄 수 있는 서로 보완하면서도 일관된 결과를 나타낼 수 있다. 본 연구에서는 당단백질 의약품의 가장 중요한 품질 결정 요소인 당화 (N-glycan Profile)를 분석하기 위한 분석법 개발을 수행하였고, $NESP^®$ 바이오시밀러인 LBDE의 종합적인 특성분석에 대한 연구를 수행하였다.
치료용 당단백질 의약품의 N-glycan은 주요 품질 인자로서 단백질의약품의 개발과 제조 전체 과정에서 평가되어야 한다. 시료 준비과정에서 소요되는 시간과 분석 결과의 변동성을 줄이기 위해서, Improved 2-aminobenzoic acid Labeling에 기반한 N-glycan 분석법을 개발하였다. 이 분석법을 적용하였을 때, $Enbrel^®$의 N-glycan은 Hydrophilic Interaction Chromatography에서 15개의 주요 구조체들이 개별 피크로 분리가 되었고, 이들에 대한 정량분석을 수행할 수 있었다. 2-AA Labeling된 N-glycan을 In-line으로 연결된 Q-TOF MS에 주입하여 구조 분석을 하였다. Q-TOF MS로 Mass값을 측정함으로써, 15 개의 주요 N-glycan과 18개의 함량이 적은 N-glycan 구조를 확인하였다. 뿐만 아니라, 14개의 주요 N-glycan에 대해서는 각 N-glycan에 대한 MS/MS Data를 얻고 이를 해석함으로써, 구조를 확실하게 규명하였다. $Humira^®$는 주로 중성 N-glycan을 갖고 있고, $NESP^®$는 많은 시알산이 부착된 N-glycan이 결합되어 있는데, 이들 N-glycan을 분석하는데도 Improved 2-aminobenzoic acid Labeling에 기반한 N-glycan 분석법이 성공적으로 적용되었다. 바이오시밀러 개발을 위해 2.5년동안 얻은 $Enbrel^®$의 누적결과를 살펴 보면, 이 분석법이 높은 수준의 결과 일관성을 제공할 수 있음을 알 수 있었다. 종합해보면, Therapeutic Glycoprotein이 갖고 있는 다양한 구성의 N-glycan들을 분석하기 위해서, Improved 2-AA Labeling에 기반한 N-glycan 분석법을 사용하게 되면, 높은 분석 효율성을 얻고, 결과의 일관성을 확보할 수 있다는 것을 확인하였다.
바이오 시밀러 제품은 허가 기관에서 승인을 받기 위해서 물리화학적 그리고 생물학적 특성분석을 통해 오리지널 제품과의 동등성을 입증해야 한다. 다베포에틴-알파 바이오시밀러인 LBDE와 다베포에틴-알파 원약인 $NESP^®$와의 동등성을 평가하기 위해 종합적인 물리화학적 그리고 생물학적 특성분석을 수행하였다. 단백질의 일차 구조와 고차 구조는 LC-MS를 사용한 Lys-C Peptide Mapping 분석, Disulfide Bond 확인분석, Circular Dichroism 및 Fluorescence Spectroscopy을 통하여 확인하였다. Glycosylation과 Isoform 분포는 MS, LC 그리고 Capillary Zone Electrophoresis를 사용하여 분석하였다. 크기 변이체는 SEC-HPLC와 SDS-PAGE 분석으로 확인하였다. 생물학적 특성분석 항목으로는 Human Erythropoietin Receptor와의 결합력 분석, In-vitro Cell Proliferation 및 In-vivo Potency를 평가하였다. 또한, Rat을 사용하여 2개의 경로에 대한 Pharmacokinetics (PK) 연구도 수행하였다. Non-reducing과 Reducing조건에서의 Lys-C Peptide Mapping은 LBDE와 $NESP^®$간에 유사한 Profile을 나타내었는데, 이로써 LBDE와 $NESP^®$간에 일차구조와 Disulfide Bond가 동일함을 확인하였다. Glycosylation과 Isoform 분포결과에서 결합되어 있는 N-glycan과 O-glycan의 종류가 동일하고, 상태 함량이 유사함을 확인하였다. LBDE의 Spectroscopic Spectra는 $NESP^®$와 매우 유사한 Profile을 나타내었다. LBDE와 $NESP^®$의 SEC-HPLC 분석에서는 매우 적은 양의 크기 변이체 (HMW)가 확인되었고, SDS-PAGE에서는 Minor Band가 나타나지 않았다. 또한, LBDE는 Human Erythropoietin Receptor와의 결합력 분석, In-vitro Cell Proliferation 및 In-vivo Potency에서 $NESP^®$와 차이를 보이지 않았다. LBDE의 PK Parameter도 $NESP^®$와 일치하는 결과를 보였다. 따라서, LBDE는 구조와 기능에 있어서 $NESP^®$와 높은 유사성을 갖는 것으로 평가되었다.
결론적으로, 3종류의 당단백질 의약품 ($Enbrel^®$, $Humira^®$, $NESP^®$) 에 대하여 Improved 2-aminobenzoic acid Labeling에 기반한 N-glycan 분석법을 성공적으로 개발하고 최적화하여 적용할 수 있었다. 그리고, $NESP^®$ 바이오시밀러인 LBDE에 대하여 20개의 물리화학적 특성분석법과 4개의 생물학적 특성분석법을 개발하여 적용함으로써, LBDE와 $NESP^®$가 매우 유사한 특성을 가지고 있음을 확인하였다.
