Novel enzymes are essential to establish green and sustainable catalysis for environment-friendly, safe, and cost-effective bioprocesses. In the last two decades, well-studied techniques such as directed evolution and gene mining from metagenome libraries have been developed to create new industrial enzymes. These methods commonly require large genetic libraries and effective selection methods for the desired catalytic activities, while the latter mainly burdens the development of economically feasible bioprocesses. In this regard, I challenged to reduce the screening burdens by developing a single-cell assay system that consists of genetically-encoded enzyme sensors and fluorescence-activated cell sorting (FACS). Efficacy of the developed technology was probed by four cases: i), a phenol-responsive biosensor was designed and developed for directed evolution of new phenol-lyase from similar protein scaffold; ii), the phenol biosensor with improved sensitivity was applied for the mining of cellulase gene from metagenome; iii), a cellobiose-responsive biosensor was designed for the screening of exo-type cellulase from various metagenomes; iv), a cellobiose-inducible transcriptional regulator, CelR was characterized by determining crystal structure and studying mutations for further application of biosensors.
To create new phenol-lyase activity, saturation mutagenesis of target sites was carried out using a 40% homologous indole-lyase. All target sites were in proximate to the active site. A phenol-sensitive genetic sensor, namely Genetic Enzyme Screening System (GESS) and FACS-based screening was applied to isolate phenol-lyase positive clones from the library of indole-lyase. GESS is a transcriptional regulator based-genetic circuit using a DmpR which responds to phenolic derivatives and subsequently activate the expression of a reporter, green fluorescent protein. GESS-based screening of libraries resulted in the evolutionary creation of the final variant harboring D137P, F304D, V394L, and I396R mutations. The variant showed a significant level of phenol-lyase activity, while completely losing the original indole-lyase activity.
To extend the applicability of GESS, the wild-type DmpR regulator was replaced with a mutant DmpR (E135K) and the new GESS was characterized with p-nitrophenol (pNP)-mediated transcriptional activation which is not observed in original GESS. After optimizing the screening protocol, a single-cell based high-throughput screening platform responding to pNP was successfully developed and applied to screen cellulase from metagenome library with pNP-substrate, p-nitrophenyl β-D-cellotrioside. After flow cytometry sorting and further CMC (carboxymethyl cellulose) assay, two clones showing cellulolytic activity were successfully isolated from the metagenome library.
To develop a GESS-based high-throughput screening method specific for exo-type cellulase, a whole-cell biosensor detecting cellulolytic activity was created using a cellobiose-inducible transcriptional regulator, CelR from Thermobifida fusca. This new GESS was named as cellobiose-detectible genetic enzyme screening system (CBGESS) that recognizes cellobiose and activate transcription of its downstream gfp reporter gene. The fluorescence intensity of CBGESS was directly proportional to the concentration of cellobiose. The capability for in vivo quantification was demonstrated through analyzing the cellulolytic activity with two cellulosic substrates, CMC and p-nitrophenyl β-D-cellobioside in cellulase-expressing Escherichia coli. In addition, CBGESS easily sensed crystalline cellulolytic activity of commercial Celluclast 1.5L when Avicel was used as a crystalline substrate. Because exo-type cellulases are very difficult to be found through conventional screening methods, CBGESS would be a powerful tool for screening of exo-type cellulases from genomes and environments.
To design a novel GESS by engineering CBGESS, the first structure of CelR in complex with cellobiose was determined for the first time. CelR consists of two domains (N-terminal DNA binding domain and C-terminal regulatory domain) and exists as a homodimer with each cellobiose sandwiched between the interface of N-terminal and C-terminal subdomain of regulatory domain. Leu59 lies on the putative hinge region as “Leucine Lever” that is crucial for transcriptional activation. A distinctive α4-helix of CelR mediates the ligand binding signal to transcriptional activation and contributes to structure stabilization. From mutation studies, we found that Tyr84 and Gln301 in the active site of CelR recognizes cellobiose as ligand.
Overall, these results showed that the genetically-encoded biosensors using transcriptional regulators can be powerful toolkits for enzyme engineering and metagenome mining. Therefore, I believe, my study contributes to provide new solutions for synthetic biology and biotechnology related with new enzyme developments.
효소는 상온, 상압의 조건에서 높은 기질 특이성, 광학선택성 등의 특성을 지녔으며, 이러한 효율적인 효소는 환경친화적이며 지속 가능한 생물학적 산업을 구성하는 핵심 바이오소재이다. 산업적으로 유용한 효소를 개발하는 방법으로 효소를 분자진화적 방법으로 개량하거나 메타게놈에서 탐색하는 방법 등이 있다. 이러한 효소발굴방법은 대량의 라이브러리를 필요로 하며, 이를 분석하기 위해선 효율적인 효소고속탐색방법이 필요하다. 유세포분석기 (flow cytometer)를 이용한 단일세포기반 생물학적 감지는 이러한 대량의 라이브러리를 분석할 수 있는 유용한 분석방법이 될 수 있다.
본 연구에서는 재설계 유전자 회로 (GESS)의 고속탐색방법과 분자진화적 효소개량방법을 이용하여, 40 % 정도의 상동성이 있는 indole-lyase 구조에 phenol-lyase 활성을 부여하였다. GESS는 페놀을 인지하여 하부 유전자를 발현시키는 전사조절인자 (DmpR)를 재설계 유전자 회로에 적용하여, 단일세포 내에서 효소 활성을 형광단백질로 전환하여 감지하는 효소고속탐색방법이다. 먼저, 대장균 유래의 indole-lyase에 기질반응성과 관련된 잔기를 선정, 무작위변이 (saturation mutagenesis)와 유전자셔플 (DNA shuffling)을 이용한 변이방법을 이용하여 라이브러리를 제작하였다. 이렇게 만들어진 라이브러리는 재설계 유전자 회로와 유세포분석기를 통해 새로운 효소활성을 나타내는 세포를 선별하였다. 이러한 탐색과정을 거쳐 최종적으로 4개의 잔기에 변이 (D137P, F304D, V394L, I396R)를 통해 phenol-lyase 효소활성을 나타내는 새로운 효소를 개발하였다.
또한, 재설계 유전자회로의 기질 확장성을 위해, 페놀링의 4번 탄소 위치에 니트로기가 붙은 분자 (4-nitrophenol, pNP)를 감지하는 변이 전사조절인자 (mutant DmpR, E135K)를 이용한 유전자회로를 구축, 분석하였다. 또한 유전자회로의 염색체 삽입을 통한 세포간 신호 안정화를 이용, pNP 기질을 이용할 수 있는 효소고속탐색용 균주를 개발하였다. 또한 para-nitorphenyl cellotrioside 를 기질로 이용하여 메타게놈 유래 섬유소분해효소를 탐색, 유전자회로를 이용한 고속탐색 및 CMC 분석을 통해, 최종적으로 2개의 endo-type 섬유소분해효소활성을 가진 클론을 선별하였다.
그리고 셀로비오스 (cellobiose)를 감지하는 전사조절인자 (CelR)를 이용하여 섬유소분해효소 분석용 재설계 유전자 회로 (CBGESS)를 구축하였다. 구축된 유전자 회로는 셀로비오스 농도에 따른 정량적인 형광반응을 나타내었으며, 세포 내 섬유소분해효소의 활성을 형광으로 분석 가능하게 하였다. 또한 섬유소 자원활용을 위해 가장 중요한 성질인 결정형 섬유소 (crystalline cellulose)에 대한 효소활성 역시 유전자 회로를 이용하여 분석 가능한 것으로 나타났다.
한편, 셀로비오스 감지 전사조절인자의 결정화하여 3차 구조를 규명하였다. 이를 통해 전사조절인자의 특성, 리간드 결합 잔기, 유전자 결합 원리 등을 분석하였으며, 특히 유전자회로 신호 조절이나 리간드 결합 특성 변화에 영향을 미칠 것으로 예측되는 Tyr84 와 Gln301을 선별, 분석하였다.
이러한 전사조절인자를 이용한 유전자 회로의 효소고속탐색방법은 효소개량이나 메타게놈 유래 효소탐색에 유용하게 사용할 수 있음을 나타내었다. 또한 합성생물학적 유전자 회로 설계 및 바이오파트 개발 및 이를 이용한 효소탐색을 수행하였다. 이러한 합성생물학적 설계 및 유전자회로를 이용한 분석, 탐색방법은 대량의 라이브러리에서 효소의 고속탐색 및 분자수준에서의 개량 등의 다양한 연구분야에 사용될 수 있을 것으로 기대한다.
