The role of TATA sequence from -4 to -1 of T7 and SP6 promoter in transcription efficiency was investigated with promoter variants carrying all the possible multiple and single mutation at this region having A:T or T:A base pair. Under supercoiled template conditions in vitro transcription activities of T7 mutant promoters were not reduced significantly compared to the wild type at 37℃ and 25℃. However when linear templates are used, the relative transcription activity of each mutant promoter varies substantially depending on its sequence. All mutants are less active than the wild type and generally mutants needing more free energy for melting are less active especially at lower temperature 25℃. It means that instability of this region affects transcription activity. Unexpectedly, activities of the mutants having the same free energy change but different sequences are diverse, which means that there is also a sequence effect on transcription activity besides melting energy effect of DNA duplex itself. Within the mutant promoters having similar DNA duplex stability, the mutations at -4 and -3 make promoter substantially more weak in promoter activity than the mutations at -2 and -1.
In contrast to results of T7, transcription activities of SP6 promoters at supercoiled condition are diverse depend on its sequence. Alteration at -4 reduces promoter activity seriously and change at -3 also reduces the activity even though the effect is less than that of -4. Effect of base pair alterations at -2 and -1 are relatively less than those of -4 and -3. When linear templates are used, the relative transcription activities of all mutant promoters are diminished less than 20%. So, it can be suggested that TATA sequence in T7 promoter concerns major melting of DNA duplex and that of in SP6 promoter does not only melting but also specific binding with RNA polymerase.
파아지 T7과 SP6 전사촉진제 내 -4에서 -1위치의 염기서열 (TATA)이 전사효율에 미치는 영향을 규명하기 위하여, 이 부위에 A:T 또는 T:A 염기쌍을 갖는 단일변이와 다중변이 전사촉진제를 만들고 이들의 전사능력을 시험관내에서 비교하는 실험을 수행하였다. Supercoil된 DNA를 주형으로 사용했을 때 T7 돌연변이 전사촉진제들의 전사능력은 37℃와 25℃의 어느 온도에서나 야생형에 비하여 크게 감소하지 않았다. 그러나 linear DNA 주형인 경우에는 각각의 돌연변이 전사촉진제의 전사능력이 각각의 염기서열에 따라 큰 차이를 나타냈다. 모든 돌연변이 전사촉진제는 야생형보다 낮은 전사능력을 보였고, 일반적으로 DNA풀림에 많은 자유에너지를 필요로 하는 전사촉진제는 더욱 낮은 전사능력을 보였으며, 특히 25℃의 낮은 온도에 서는 이러한 현상이 두드러졌다. 이것은 전사촉진제의 TATA 염기서열 부위의 불안정성이 전사능력에 영향을 미치고 있음을 의미한다. 또한 동일한 자유에너지 변화의 값을 갖되 염기 서열은 서로 다른 돌연변이들의 전사능력은 다양한 양상을 보였는데, 이러한 결과는 DNA 이중나선의 풀림 에너지 효과 외에 염기서열 효과도 함께 존재함을 말해준다. 유사한 DNA 이중나선의 안정성을 가진 돌연변이 전사촉진제 중에서 -4와 -3위치의 돌연변이가 -2와 -1위치의 돌연변이 보다 전사능력을 크게 떨어뜨렸다.
T7과는 달리, SP6 전사촉진제는 supercoil된 DNA를 주형으로 사용한 경우에도 그 전사능력이 염기서열에 따라 다양하게 나타났다. -4위치의 변이는 야생주에 대한 상대적 전사효율을 20% 이하로 크게 감소시켰고, -3위치의 변이는 -4위치의 변이보다 그 효과가 크지는 않았지만 50% 정도로 감소시켰으며, -2와 -1위치의 변이는 -4와 -3위치의 변이보다 염기서열 변화의 효과가 상당히 작게 나타났다. Linear DNA 주형에서 SP6 돌연변이 전사촉진제들의 상대적인 전사효율은 야생형의 20% 이하로 떨어졌다. 결론적으로 T7 전사촉진제의 TATA 염기서열은 주로 DNA 이중나선의 풀림에 관계되고, SP6 전사촉진제의 경우에는 풀림 외에도 RNA 중합효소와의 특이적인 결합과도 관계있음을 알 수 있다.
