A gene(estB) coding for carboxylesterase (EC 3.1.1.1), esterase II, of Pseudomonas fluorescens cloned into Escherichia coli JM83 was analyzed by nucleotide sequence analysis. DNA sequencing revealed a single open reading frame for esterase II, confirmed by N-terminal amino acid sequence analysis of the purified esterase protein. The promoter-like structure(-10 and -35 regions) and a potential Shine-Dalgarno sequence are followed by the coding sequence of estB gene.
The carboxylesterase was purified by means of ion-exchange chromatography and gel filtration. Homogeneity of the purified enzyme was confirmed using SDS-polyacrylamide gel electrophoresis. The molecular weight of the subunit of esterase II determined by SDS-polyacrylamide gel electrophoresis and that of native form determined by gel permeation chromatography were 23,000 and 44,000, respectively, indicating that the enzyme exists as a dimer consisting of two identical subunits. The enzyme was maximally active at 45℃ and the optimum pH range was found to be from pH 6.0 to 9.0. The enzyme hydrolyzed methyl esters of short chain fatty acids(C2-C6) as well as phenyl acetate. Esterase II activity was strongly inhibited by DFP and PMSF but not by DTNB. The results of the experiments for determining substrate specificity and the inhibitor studies suggest that this enzyme is a carboxylesterase (EC 3.1.1.1) and a serine residue is present at the active site or substrate binding site of the esterase, as for the esterases of animal tissues.
대장균에 cloning 된 Pseudomonas fluoroscens SIK W1 균주의 carboxylesterase (esterase II)를 encoding 하는 유전자 (estB)의 DNA 염기서열을 분석하였다. estB 유전자에는 translation 개시 codon 인 ATG 로 부터 시작하는 ORF (open reading frame) 가 있음이 밝혀졌고, 이 ORF 는 순수 정제된 carboxylesterase (esterase II) 의 N-terminal amino acid sequence 분석을 통해 확인되었다. ORF 의 앞쪽에는 promoter 라고 믿어지는 구조 (-10과 -35 지역)와 Shine-Dalgarno sequence 가 존재한다.
Carboxylesterase (esterase II) 는 플라스미드 pUE172 를 갖고있는 형질 전환된 대장균으로부터 순수 정제되었다. 이 효소는 주로 세포내에 존재하며, ion-exchange column 크로마토그래피와 gel filteration 을 통하여 순수하게 분리되었다. SDS-polyacrylamide gel 에서의 전기영동과 gel filtration 크로마토그래피 (Sephacryl S-200) 등의 실험 결과로 이 효소의 subunit 의 분자량은 23,000 dalton 이며, active 한 형태는 두개의 동일한 subunit 로 이루어지는 dimeric form 임이 밝혀졌다. 이 효소는 pH 6.0에서부터 9.0 사이에서 최대 활성을 보였고, 최적 온도는 45℃ 였다. 이 효소의 기질 특이성을 결정하는 실험과 여러가지 효소 활성 저해제의 적용 효과에 대한 실험 결과를 근거로 이 효소는 carboxylesterase (EC 3.1.1.1) 로 분류되었고, 이 효소의 활성부위 혹은 기질 결합부위에는 serine 잔기가 위치하고 있음을 알 수 있었다.
