Expression genetics is becoming a new approach to the identification of cancer-related genes. In this point, cytokines seems to have an important role since it systemically regulates cells. They contribute to a wide range of symptoms in advanced cancers. Aberrant expressions in cytokines have been reported in some cancer types and stages. Alternative splicing is an essential biological process that generates multiple different transcripts from the same precursor mRNA. It is an important regulatory mechanism for high eukaryotic gene expression. Recently, inherited and acquired changes in pre-mRNA splicing have been also documented to play a significant role in human disease development and many cancer-associated genes are regulated by alternative splicing. Here, the author focused on the alternative splicing of human granulocyte-colony stimulating factor (hG-CSF) and reports that exon3 skipping of hG-CSF is more related to carcinogenesis.
In part I, alternative splicing event of hG-CSF from different cell lines were investigated by RT-PCR, southern hybridization, northern hybridization and DNA chip hybridization. Among different splicing variants of hG-CSF, it was concluded that exon 3 skipping is more frequent event, in particular, in various cancer samples. An attempt to investigate the exon 3 skipping in cancer was firstly made with different cell lines by development of DNA chip which has a specific and sensitive DNA probes for differentiating each hG-CSF variant type. Clinical samples from tissues and blood were tested for analyzing exon 3 skipped hG-CSF (mG-CSF) expression frequencies. In Fisher’s Exact Test, there was statistically significant difference between cancer group and non-cancer group in tissues and non-cancer samples even though the frequency is lower than expected. However, there was no statistically significant difference between normal section and cancer section of cancer tissues, which means that exon3 skipping of hG-CSF is strongly associated with cancer and/or carcinogenesis.
In part II, mG-CSF expression induced by carcinogen treatment and normal hG-CSF was discussed. Thioacetamide (TA) is a weak carcinogen specific for the liver carcinogenesis. Its short term exposure gives reversible premalignant states. It was examined that carcinogen TA treatment induced hG-CSF and mG-CSF expression. It is likely that mG-CSF and hG-CSF expression seem to be early response genes since they expresses within 2 to 4 hours after TA treatment. Recently, it was reported that hG-CSF expression correlates with increased tumor proliferation and vascularization in human meningiomas. Increased cytokine expression has been reported in many types of cancers. In particular, mG-CSF expression may be positively related to carcinogenesis in addition to the increased cytokine expression. mG-CSF expression may be also positively related to hG-CSF expression and carcinogenesis. We also found that hG-CSF induces mG-CSF expression which seems to be by p38 and JNK pathway.
In part III, simple patterning of biomolecules by using photolithography was discussed. For the further application of these newly found cancer-associated genes and proteins, development of molecular cancer detection system is also useful and if it is combined with patterning methods, it can be used for various purposes since DNA chip is still limited to DNA based assay. The author reported the very simple immobilization methods for the further application for cell-protein-and DNA based assay. In this thesis, cells and DNAs were successfully immobilized and patterned with having its own activity, which opens new assay method applicable in various different fields such as biosensors for monitoring and diagnosis and/or cell engineering for constructing mimicking in vivo system to study the effects on cells. An attempt was also made to diagnose most common corneal dystrophies caused by mutations in the $TGF-\beta$ induced ($\beta igh3$) gene by utilizing the chip system, which was successfully applied to cancer diagnosis based on the alternative splicing of G-CSFs in previous chapters. The author successfully diagnosed most common dystrophies with chip system.
As more papers still describe the cancer mechanisms and effective cancer markers including this newly found mG-CSF, the question arises whether the above statement could be useful tool for cancer diagnosis. The function and diagnostic importance of this newly found mG-CSF expression are needed to be studied more in detail. However, like classical biomarkers, this newly found mG-CSF has been already shown to correlate with malignancy in cancer cell lines, tissues and even in blood. Now an effort is being made to identify the novel mG-CSF protein and its usefulness as a universal cancer marker. Undoubtly, the examination between these aberrant expression of cytokines including hG-CSF and cancer will prove to be an extremely useful for the identification of a new generation of biomarkers.
암 관련 유전자를 동정하는데 있어서 발현유전학적인 접근이 새롭게 많은 방법으로 시도되어왔다. 이러한 관점에서 사이토카인의 발현은 세포의 조절에 큰 역할을 하며, 또한 암에 있어서 다양한 증후군의 생성에 기여한다. 몇 가지 암 혹은 암의 진행단계에서의 사이토카인의 비정상적인 발현이 보고되고 있다. 선택적 스플라이싱은 한가지의 mRNA전구체에서부터 많은 다른 전사체를 만드는데 중요한 생물학적 과정 중에 하나이다. 이러한 기작은 고등 진핵생물의 유전자 발현에 있어서 중요한 조절기작으로 작용한다. 스플라이싱에 있어서 선천적 혹은 후천적인 변화가 인간의 질병을 일으키는데 상당히 관련이 있다는 문헌보고가 있으며 또한 많은 암 관련 유전자가 선택적 스플라이싱에 의해 조절되고 있다. 따라서 본 논문에서는 인간 사이토카인 중에서 hG-CSF의 선택적 스플라이싱 중에서 엑손 3의 건너뛰기(결실)현상이 암의 현상 혹은 암화와의 관계에 대해 중점적으로 연구하였다.
인간 G-CSF의 선택적 스플라이싱을 다양한 다른 종류의 세포주를 가지고 RT-PCR, 서던 블롯, 노던 블롯, DNA 칩 혼성화 반응을 통해서 살펴보았다. 인간 G-CSF의 알려진 여러 개의 스플라이싱 변이체 중에서 특별히 엑손 3의 결실현상이 보다 암과 관련하여 다른 변이체보다 훨씬 많은 빈도로 암세포에서 발현되었다. 엑손 3의 결실현상과 암과의 관계는 각 변이체를 구분할 수 있는 DNA칩을 개발하여 이를 이용하여 살펴보았다. 세포주 뿐만 아니라 조직이나 혈액과 같은 임상샘플을 모집하여 인간 G-CSF의 엑손 3 의 결실현상이 마찬가지로 높은 빈도로 일어나는지 살펴보았다. 본 연구의 시도 당시의 여러 가지 세포주를 포함한 패널 스터디에서 살펴본 바와 같이 높은 빈도는 아니지만 FIsher’s Exact Test를 통해서 임상샘플에서의 G-CSF의 엑손3의 결실현상은 통계적으로도 암과 상당히 관련이 있는 것으로 나타났다. 암환자의 정상조직에서의 G-CSF의 엑손3의 결실현상은 암환자의 암조직에서의 경우보다 빈도가 훨씬 낮지만 암환자에서내에서의 암조직과 정상조직간의 차이는 통계적으로 유의하지 않은 것으로 나타났다. 이것은 인간 G-CSF의 엑손 3의 결실현상은 암 혹은 암화에 상당한 역할을 하는 것을 나타낸다.
암화 과정에서의 인간 G-CSF의 발현에 대해서 살펴보았다. Thioacetamide (TA)는 약한 발암제로서 쥐에 장기간 투여 시 간암을 유발하는 것으로 알려져 있다. TA의 짧은 기간의 투여는 가역적인 전암단계로 유도한다. 발암제 TA을 직접적으로 세포에 처리한 경우 인간 G-CSF의 발현이 유도되었다. 발암제의 처리 후 2-4시간에서 나타나는 것으로 보아 엑손 3의 결실이 된 G-CSF (mG-CSF)와 hG-CSF는 조기발현유전자로 보인다. 최근에 G-CSF의 발현이 병리수막증(meningiomas) 에서의 암의 증식과 혈관형성과 관련해서 증가한다는 보고가 있다. 사이토카인의 발현의 증가는 이미 많은 암에서 보고되어 왔다. 특별히, 인간 mG-CSF의 발현은 사이토카인의 암에서의 발현 증가와도 관련이 있는 것으로 사료된다. 엑손이 결실되지 않은 G-CSF의 처리는 또한 mG-CSF의 발현은 유도하는 것으로 나타나는데 이는 p38과 JNK 경로와 관련 있는 것으로 보인다.
앞에서 발견된 mG-CSF에 대한 응용적인 관점에서 보다 다양하게 암을 진단하고 암의 현상을 연구하는데 응용이 가능한 패터닝을 시도하여 보았다. 분자생물학적 암의 진단은 이러한 패터닝기술과 결합될 때 세포수준에서, DNA수준에서, 단백질 수준에서의 분석이 가능하다. 본 연구에서는 세포와 DNA를 포토레시스트를 이용하여 세포 및 DNA의 자체의 활성도를 잃지 않고 세포 및 DNA를 성공적으로 고정하고 패턴화할 수 있었다. 또한 G-CSF의 선택적 스플라이싱을 기초로 해서 암진단에 성공적으로 적용할 수 있었던 DNA 칩 기술을 이용하여 사이토카인 $TGF-\beta$ 에 의해 유도되는 단백질의 유전자인 $\beta igh3$의 유전자의 돌연변이로 가장 빈번히 일어나는 각막질환을 성공적으로 진단할 수 있었다.
암의 기작에 대한 많은 연구에 대한 많은 보고가 있어왔고, 이렇게 새롭게 발견된 mG-CSF의 기능이 성공적으로 암진단 마커로써 응용되기까지에는 더욱 더 많은 연구가 필요할 것이다. 본 연구에서 발견된 mG-CSF의 발현의 진단적인 기능과 중요성은 암세포주, 암조직 그리고 암환자의 혈액의 연구로부터 밝혀졌다. mG-CSF의 단백질을 동정은 앞으로 유용한 암진단마커로 활용하는데 상당히 유용한 연구가 될 것이다. 결론적으로, 인간 사이토카인을 포함하여 인간 사이토카인의 비정상적인 발현에 대한 연구는 새로운 유용한 암진단 마커의 발견과 개발에 상당한 의의가 있다.
