Lateral flow assays (LFAs) provide a number of advantages as a detection platform, including simple capillary driven operation, portability, and low cost. However, they cannot handle multi-step reactions, including enzyme linked immunosorbent assay (ELISA), signal enhancement process, and a number of colorimetric reactions. To overcome this limitation of LFAs, a number of paper-based microfluidic devices that enable multi-step assays have been introduced. Nevertheless, complicated multi-step operation principle is required for multiple reagents loading. Although several paper-based microfluidic devices that perform one-step operation of multi-step assays have been proposed to improve complicated operation principle, their fabrication procedures still need to be improved. In this study, we developed a pressurized paper-based microfluidic device using both channel partition and delayed fluid flow by pressurizing nitrocellulose (NC) membrane. When the NC membrane is exposed to pressure, pores are collapsed and they play a role as a fluid resistance that results in delayed fluid flow. Furthermore, at a certain high pressure, pores are collapsed to an extent sufficient to prevent fluid flow so that collapsed pores can play a role as a channel partition. We characterized both delayed fluid flow and channel partition formation on pressurized NC membrane. By exploiting delayed fluid flow and channel partition formation, we developed a pressurized multi-channel immunostrip. Design of pressurized multi-channel immunostrip was optimized by controlling flow rate based on Darcy’s law. The pressurized multi-channel immunostrip consisted of three channels divided by two channel partitions and pressurized regions on the channels for delayed fluid flow. The immunostrip also had two detection regions for dual detection of target analytes. All the reagents re-quired for assay were pre-loaded and dried on the NC membrane. By one-step dipping the device into a sample solution, the reagents were sequentially rehydrated. Consequently, colorimetric signal for each analyte was developed by gold nanoparticle based immunocomplexes and colorimetric signal was amplified by gold enhancer that rehydrated by delayed fluid flow. As a proof of concept demonstration, we detected two kinds of fatal foodborne pathogens (Escherichia coli O157:H7 and Salmonella typhimurium) by signal enhancement. Detection limits of E. coli O157:H7 and S. typhimurium were about $10^5 CFU/mL$ and $10^6 CFU/mL$, respectively.
기존의 측면 유동 분석법은 다중 반응을 수행할 수 없는 한계점이 있었기 때문에 다중 반응을 수행할 수 있는 다양한 종이기반 미세유체 장치가 개발되었다. 하지만 이들은 다수의 시료 주입을 필요로 하기 때문에 많은 동작 과정이 요구되어 현장 진단에 적용하기 어렵다는 한계점이 있다. 이를 극복하기 위해 다수의 시료주입을 필요로 하지 않는, 한번의 작동 과정으로 다중 반응을 수행할 수 있는 종이 기반 미세유체 장치들이 개발 되었다. 하지만 이들의 제작과정은 많은 종류의 장비를 필요로 할뿐만 아니라, 유체의 흐름을 조절하는 데에 한계가 있다. 따라서 유체의 흐름을 쉽게 조절할 수 있는 간단한 공정과정에 대한 수요가 증폭되었다.
본 연구에서는 기존의 측면 유동 분석법의 재료로 널리 사용되는 나이트로셀룰로오스 멤브레인을 프레스 기계를 이용해 압착화 함으로써 지연된 유체의 흐름과, 채널 구획을 구현하였다. 나이트로셀룰로오스 멤브레인이 압력에 노출되면 공극의 크기가 감소하게 되고, 감소한 공극의 크기는 유체의 흐름에 대한 저항으로써의 역할을 하여 유체의 흐름을 지연시키는 역할을 한다. 더 나아가 나이트로셀룰로오스 멤브레인이 특정 크기의 압력에 노출되면 공극의 크기가 유체의 흐름을 차단할 수 있을 정도로 줄어들게 된다. 결국 줄어든 공극을 유체가 통과하지 못하고 이는 여러 개의 채널을 나눌 수 있는 채널 구획으로써의 역할을 할 수 있다.
본 연구에서는 지연된 유체의 흐름이 압착화를 위한 압력의 크기에 따라 다양하게 조절되는 것을 확인하였다. 또한 채널 구획이 형성되기 위해 필요로 하는 힘의 범위를 확인하였다. 최종적으로 나이트로셀룰로오스 멤브레인에서 지연된 유체의 흐름과 채널 구획의 형성을 이용하여 압착화된 다중채널 면역 스트립을 구현하였다. 압착화된 다중채널 면역 스트립의 디자인은 Darcy의 법칙에 기반한 유량 조절을 통해서 최적의 형태를 갖추었다. 압착화된 다중채널 면역스트립은 3개의 채널이 2개의 채널구획으로 나누어져 있으며 지연된 유체의 흐름을 필요로 하는 채널은 압착화된 구역을 포함하고 있다. 또한 압착화된 다중채널 면역 스트립은 2개의 검출부를 지니고 있어 표적 물질의 이중검출이 가능하다. 압착화된 다중채널 면역스트립을 간단하게 샘플 용액에 담금으로써 한번의 작동과정을 통한 표적물질들의 다중 검출이 가능하다.
본 연구에서 구현된 압착화된 다중채널 면역스트립을 2종류의 식중독균 (Escherichia coli O157:H7 와 Salmonella typhimurium)을 금나노 입자 기반의 비색반응과 그의 신호증폭을 통해 검출하였다. 2종류의 식중독균에 대한 항체가 각각 고정된 금나노 입자와 금나노 신호증폭제는 압착화된 다중채널 면역스트립에 분주된후 건조되어 사용 준비된다. 사용 준비된 압착화된 다중채널 면역스트립을 간단히 샘플용액에 담그게 되면, 건조된 시료들이 순차적으로 재수화되어 금나노 입자에 의한 비색 신호가 나타나고 금나노 신호증폭제에 의해 비색신호가 증폭되는 다중 반응이 일어나게 된다.
기존의 식중독균 검출을 위한 측면유동 분석법은 높은 효율을 위한 다중 검출 형태와 더 나은 성능을 위한 다중 반응의 형태가 존재하였다. 하지만 높은 효율과 더 나은 성능을 동시에 가질 수 있는 측면유동 분석법은 구현되지 않았다. 따라서 본 연구에서는 높은 효율과 더 나은 성능을 가질 수 있는, 또한 간단한 작동방법으로 식중독균의 검출이 가능한 면역스트립을 개발하였다. E. coli O157:H7 에 대한 검출한계는 약 $10^5 CFU/mL$ 이며, S. typhimurium 에 대한 검출한계는 약 $10^6 CFU/mL$ 이다. 본 연구에서 구현한 압착화된 다중채널 면역스트립은 간단한 한번의 작동과정으로 높은 효율과 더 나은 성능으로 식중독균들을 검출할 수 있다. 이런 의미에서 압착화된 다중채널 면역스트립은 현장에서 훈련되어 있지 않은 사람들로부터 널리 사용 가능할 것으로 기대된다.
