The dorsoventral (DV) boundary of wing imaginal disc is a signaling center for patterning and growth in Drosophila. The WD40 domain protein Ebi has been implicated in the regulation of Notch (N) signaling at the DV boundary (Marygold et al., 2011), but the underlying mechanism is unknown. Here we show that Ebi regulates wing growth by antagonizing the transmembrane protein Crumbs (Crb). We identified Ebi as a binding partner for the extracellular domain of Crb ($Crb^{ext}$). Physical interaction between Ebi and Crb is specifically mediated by the WD40 repeats 7-8 of Ebi and a laminin G domain of $Crb^{ext}$. Wing notching caused by reduced Ebi can be suppressed by decreasing the Crb function, indicating that Ebi is antagonistic to Crb. The WD40 repeats of Ebi are essential for binding Crb and antagonizing its function. Consistent with the antagonistic genetic interaction, Ebi knockdown in the DV boundary results in an upregulation of Crb protein level. We show that a fraction of Ebi and Crb proteins are localized together to the endosomal vesicles. Reduced Ebi leads to an accumulation of Crb with recycling endosomes. We reveal that Crb is ubiquitinated, and Ebi is required for the downregulation of Crb by ubiquitination. Taken together, we propose that the interplay of Crb expression and its downregulation by Ebi provides a feedback mechanism for regulated N signaling during wing development.
노랑 초파리 날개 조직의 형성과정에서 날개 성충판 (wing imaginal disc)에 있는 등배축경계면 (The dorsoventral boundary)은 날개 조직의 성장 및 형태형성에 중요한 신호들을 만드는 핵심적인 역할 (signaling center)을 한다. WD40 도메인(domain)을 지닌 Ebi 단백질은 등배축경계면에서 노치 신호전달 (Notch signaling)과정을 조절하는 역할을 한다고 알려져 있으나, 그 작용 기작 (mechanism)은 밝혀지지 않았다 (marygold et al., 2011). 본 연구는 Ebi 단백질이 세포막 단백질인 Crumbs (Crb) 의 기능을 억제하는 방식으로 날개 조직의 성장을 조절하고 있음을 다양한 방법으로 증명하였다. Ebi 단백질은 Crb 단백질과 결합하는데, 세포외부로 노출되어 있는 Crb 부위 (the extracellular domain)와 결합한다. 이 결합은 Ebi 단백질의 7-8 번 WD40 도메인과 세포외부로 노출된 Crb의 laminin G 도메인 사이에서 이루어진다. Ebi 단백질의 발현량 감소에 의해 나타나는 성충 (adult) 날개조직의 “V자 형태의 손상 (notching)”은 Crb 단백질 기능의 저하에 의해 회복 되는 것이 유전학적인 방법으로 확인되었으며, 이는 Ebi 단백질이 Crb 단백질의 기능을 억제하는 방식으로 작용하고 있음을 의미한다. Ebi 단백질에 존재하는 여러 개의 WD40 도메인은 Crb 단백질과의 결합 및 Crb기능을 억제하는데 필수적 역할을 한다. 날개 성충판의 등배축경계면에서 Ebi 단백질의 감소되는 경우, Crb 단백질의 발현량이 증가되는 것을 조직염색을 통해 확인하였다. Ebi 단백질과 Crb 단백질의 일부는 엔도좀 소낭 (endosomal vesicle)에 함께 존재하며, Ebi 의 감소는 recycling endosome 에 Crb 단백질이 축적되는 현상을 유발했다. 마지막으로 Ebi 단백질은 Crb단백질이 유비퀴틴화 (ubiquitination) 되어 제거되는데 필요함이 확인되었다. 이러한 결과들은 전체적으로, Ebi 에 의한 Crb 단백질의 발현 감소와 기능억제 과정이 날개조직의 발생에 필요한 노치 신호전달 과정을 조절하는 피드백 과정으로 작용하고 있음을 시사 하고 있다.
