For production of HA with high molecular weight, yeast has been engineered. Saccharomyces cerevisiae and Pichia pastoris have been used as a host due to advantages of large UDP-sugars’ pool and easy genetic manipulation. The codon-optimized genes of hyaluronan synthase and UDP-glucose dehydrogenase form Xenopus laevis were expressed in S. cerevisiae and P. pastoris. The transcription of genes has been confirmed by RT-PCR. The concentration of hyaluronic acid from recombinant P. pastoris was about 200mg/L while that from recombinant S. cerevisiae was about 150mg/L. The recombinant P. pastoris was thus chosen to as a suitable host for HA production.
The genes of HA pathway have been overexpressed by several combinatorial expression cassettes. EJP strain overexpressing HA pathway genes has been established. EJP-D, EJP-CD and EJP-CDE cells have been further constructed, by introducing more copied of the HA expression cassette and produced 1.6g/L HA with 1.2MDa, 1.7g/L with 1.2MDa, and 1.2g/L with 1.3MDa, respectively.
The hyaluronan synthase from X. laevis can produce HA in MW raging to spanning to 10MDa in in vitro in presence of sufficient UDP-sugars. To produce HA with higher molecular weight, the expression level of hyaluronan synthase has been altered by replacement of AOX1 promoter with AOX2 promoter. The AOX2 promoter has one-tenth the activity of the AOX1 promoter. The EJW, EJWP-CD, and EJWP-CDE cells produced HA with 1.5MDa, 2.1MDa and 2.0MDa, respectively. The MW of HA from EJW series cells is much higher than one (1.2MDa) obtained from EJP cells. On the other hand, total production amounts of HA from EJW series cells were smaller than these obtained with EJP cells. Due to the reduced expression of hyaluronan synthase on the cell membrane, the total HA yield was decreased.
Low-temperature cultivation has a meaningful effect on the MW of HA. The MW of HA is produced at various temperatures using EJWP-CDE cells. In the experiments, cultivation of the cells started at 30℃ following a glucose feeding phase at the same temperature. Then, the temperature was changed at the induction phase. As expected, the size of the HA polymer was dependent on temperature. EJWP-CDE cells which were cultured at 26℃ produced the highest MW of over 2.5MDa, while the cells that were cultured at 30℃ produced the lowest MW of 2MDa. The result indicates that low-temperature cultivation helps to flux from cell wall synthesis to HA synthesis.
히알루론산은 선형의 다당류로 N-아세틸글루코사민과 글루쿠론산이 교대로 사슬모양으로 결합한 분자량이 큰 고분자화합물이다. 다양한 분자량의 분포를 가지며 피부, 눈, 탯줄과 연골등에 풍부하게 존재한다. 몸을 이루는 중요한 역할을 감당하는 요소이기 때문에 의약품, 화장품, 그리고 기능성식품등에 많이 이용된다. 히알루론산 시장은 급격히 증가하여 2010년에 14억달러규모였고 계속 증가하고 있어 그 중요성이 커지고 있다. 히알루론산은 분자량이 클수록 고부가가치이므로 큰 분자량의 히알루론산을 생산하는 것이 이슈이다.
그동안 히알루론산은 닭벼슬이나 탯줄에서 화학적인 방법으로 추출해왔는데 이로부터 얻은 히알루론산은 5백메가달톤정도의 고분자량을 가진 고부가 가치였지만 추출하는 공정이 아주 복잡하고 수요에 비해 생산량이 현저히 적었다. 이를 극복하기위해 스트렙토코커스균을 이용한 히알루론산생산을 많은 기업에서 시도를 하여 대량생산이 가능해졌다. 하지만 이에 사용되는 스트렙토코커스균은 병원균이기 때문에 정제과정에서 독소를 모두 제거해야하고 닭벼슬에서 추출한 히알루론산보다 분자량이 현저히 적은 1백메가달톤정도가 생산이 되고있다.
이를 극복하기위해 많은 그룹에서 그라스(GRAS)로 알려진 이콜라이, 락토코커스, 바실러스 등의 균주에 스트렙토코커스균의 히알루론산합성효소를 도입하여 히알루론산을 생산하고자 시도를 하였지만 안정성의 향상외에는 양적으로나 질적으로 향상되지 못했다. 그 중에 바실러스를 개량한 균주는 기업에서 상업화에 성공하였다.
미생물을 이용하여 고분자의 히알루론산을 생산하기위해서는 극복해야할 문제들이 몇가지 있다. 첫번째는 전구체의 양이다. 세포내에 존재하는 전구체의 양이 많아야 더 큰 분자량을 가진 히알루론산을 생산할 수 있다. 두번째는 세포성장에 의한 히알루론산의 합성억제이다. 히알루론산을 이루는 두 물질, 즉 글루쿠론산과 N-아세틸 글루코사민은 세포벽의 전구체이기도 하다. 그렇기 때문에 세포가 성장할 때에는 스스로 히알루론산의 합성을 억제한다. 세번째는 히알루론산분해효소의 영향이다. 합성된 히알루론산을 분해하므로 분자량이 낮아질수 있다.
안정성을 유지하면서 스트렙토코커스보다 양적, 질적으로 향상된 히알루론산의 생산을 위해 이번연구에서는 효모를 사용하였다. 효모는 박테리아보다 볼륨이 500배이상 커서 상대적으로 더 많은 전구체를 보유한것으로 보고 되어있고, 세포성장속도도 4배정도 느려서 세포성장에 의한 히알루론산의 생산억제를 극복할 수 있다. 그리고 히알루론산분해효소가 없어 히알루론분해효소에의한 분자량감소문제를 배제하여도 된다.
히알루론산을 생산하기에 적합한 효모를 찾기위해 두 종류의 가장 많이 사용되고 조작이 쉬운 효모인 사카로마이시스 세레비지아와 피키아 패스토리스를 사용하였다. 또한 히알루론산 생산에 필요하지만 효모에는 없는 효소를 위해 개구리인 제노퍼스 라에비스의 히알루론산 합성효소와 UDP-글루코스 가수분해효소를 도입함으로써 스트렙토코커스의 합성효소를 이용하는 것보다 안정성을 높였다. 이 두 효소를 발현시킨 효모에서 50ml 플라스크에서 48hr동안 배양하여 히알루론산을 생산하였고 양을 비교한 결과 사카로마이시스균주에서는 약 150mg정도, 피키아균주에서는 200mg 정도 생산되었다. 양과함게 멀티카셋을 만들 수 있는 벡터의 용이함을 이유로 피키아 패스토리스를 히알루론산 생산을 위한 타겟호스트로 정하였다.
히알루론산의 분자량을 높이는데 가장 중요한 전구체의 양을 늘리기 위해 히알루론산 합성경로에 있는 중요한 유전자를 과발현시켰다. 히알루론산 합성에 가장 중요한 역할을 한다는 다섯개의 유전자 중 합성효소를 뺀 4개의 유전자를 항상 발현되도록 과발현을 하였고 더 많은 발현을 위해 유전자들을 여러조합으로 한카피씩 더 도입하여 EJP-D, EJP-CD, EJP-CDE의 균주를 확립하였다. 이 균주들을 배양하여 히알루론산을 정제한결과 EJP-D균주는 1.6g/L를 생성하고 그 분자량은 1.2백메가달톤 정도 되었다. EJP-CD균주는 1.7g/L을 생성하고 그 분자량은 1.2백메가달톤이었다. EJP-CDE균주는 1.2g/L를 생성하고 분자량은 1.3백메가달톤이었다. 이 균주들은 전구체관련 유전자를 과발현하기 전의 양과 분자량을 비교하였을 때 양은 200mg/L에 비해 6배에서 9배정도 향상하였고 분자량은 2천5백메가달톤보다 무려 6배정도 상승하였다.
전구체관련 유전자를 과발현함으로써 분자량을 늘렸지만 개구리의 히알루론산 합성효소는 인비트(In vitro)로 상에서 20MD에 달할정도로 활성을 가진 효소이다. 히알루론산 합성효소 역시 강력한 프로모터에 의해 발현되는데 합성효소의 발현정도를 약화시키면 하나의 합성효소가 상대적으로 더 많은 전구체를 차지하게 되므로 더 긴 히알루론산 체인을 합성할 수 있을 거라고 전제하고 히알루론산 합성효소의 프로모터를 AOX1프로모터에서 발현능력이 약 1/10정도 낮은 AOX2프로모터로 치환하여 균주를 만들고 실험을 하였다. 프로모터가 치환된 균주를 EJW균주로 명명하고 전구체관련효소를 한 카피씩 강화한 균주를 EJWP균주로 하고 여러조합으로 전구체관련 효소를 한카피씩 더 도입한 균주를 각각 EJWP-CD와 EJWP-CDE균주로 명명하였다. EJW, EJWP-CD 그리고 EJWP-CDE균주를 배양한 결과 EJW균주는 0.6g/L를 생산하고 분자량은 1.5백메가달톤에 달하였다. EJWP-CD균주는 약 1g/L를 생산하고 분자량은 2.1백메가달톤이었다. EJWP-CDE균주는 0.9g/L를 생산하고 그 분자량은 2.0백메가달톤이었다. 결론적으로 히알루론산 합성효소의 발현량을 조절하여 전구체를 과발현 한 균주보다 약 160% 더 높은 분자량을 가진 히알루론산을 생산할 수 있었다.
히알루론산의 전구체는 글루쿠론산과 N-아세틸글루코사민인데 이 전구체는 세포벽을 이루는 물질이기도 하여 세포가 성장을 하고 있을 때는 세포 스스로 히알루론산의 합성을 저해하고 세포벽의 합성으로 전구체를 사용한다. 효모는 세포의 성장이 박테리아 보다 느려서 세포성장에 의한 저해를 상대적으로 덜 받지만 세포성장에 의한 저해를 더욱 덜 받기위해 배양시 온도를 낮추어 히알루론산을 생산하였다. 24, 26, 28, 30도로 EJWP-CDE세포를 배양하였고 26도에서 2.5백메가에 달하는 높은 분자량을 얻었다. EJP-CD, EJP-CDE, EJWP-CD균주들도 26도에서 배양하여 30도에서 배양했을 때 보다 더 높은 분자량을 얻었다. 상대적으로 히알루론산 생산량은 30도에서 배양했을 때에 비해 70~80%정도로 주었지만 분자량은 120~150%정도 향상되었다.
결론적으로 효모를 타겟균주로 하고 개구리의 히알루론산합성효소를 이용하여 히알루론산을 생산하였다. 분자량을 높이기 위해 히알루론산 전구체관련 효소들을 여러조합으로 과발현하였고, 합성효소의 발현량을 조절하여 하나의 합성효소가 상대적으로 더 많은 전구체를 소유함으로써 더 높은 분자량의 히알루론산을 생성하도록 하였다. 마지막으로 세포성장의 의한 히알루론산합성 저해를 극복하기 위해 다양한 온도로 배양을 하였고 최적의 온도인 26도를 찾아냈다. 이렇게 여러 단계를 균주를 개발하고 조건을 최적화하여 0.8~1.7g/L의 히알루론산을 생산하였고 최대 2.5백메가 이상의 분자량을 가진 히알루론산을 생산하였다.
