Recent studies have shown that RNAs act as active molecules in the regulation of various cellular metabolism processes and plays a key role in cancer development or other disease progression. Their biological roles depend on the three-dimensional structures, although specific sequences have been shown to be crucial for various functions. Therefore, analysis of the RNA conformation in cells is essential for understanding their roles.
First, we devised a novel tool for detecting and analyzing RNA conformation by anti-RNA antibody. We have developed an efficient strategy for panning and affinity maturation of human monoclonal antibodies binding to RNA from a na"ive antigen binding fragment (Fab) combinatorial phage library, using brain cytoplasmic 200 (BC200) RNA as the antigen. BC200 RNA, a neuron-specific noncoding RNA, is implicated in the inhibition of local synaptodendritic protein synthesis in human cells, and shown to be expressed at higher levels in invasive carcinomas than benign tumors of the breast. Using panning and affinity maturation, we identified MabBC200-A3 as the optimal binder, which interacted specifically with two regions (residues 76 to 85 and 96 to 104) of BC200 RNA with a dissociation constant of ~7 nM. Expression of BC200 RNA in various breast cancer cell lines was further examined using conventional hybridization and immunoanalysis with MabBC200-A3. When total cellular RNAs purified from cells were subjected to hybridization, the signals varied significantly among the cell types. Similar variability of BC200 levels among cell lines was observed upon immunoanalysis with the antibody. Furthermore, the antibody was able to discriminate BC200 RNA from homologous 7SL RNA, supporting its utility as a specific probe for the RNA. Intriguingly, however, when permeabilized cells were used instead of purified total cellular RNA, the amounts of antibody-recognizable BC200 RNA were different, indicating that BC200 RNA exists as at least two distinct cellular forms (antibody-recognizable and nonrecognizable), depending on the structural integrity of the antigenic RNA motif and its accessibility to the antibody. Our data clearly demonstrate the value of the anti-RNA antibody as a novel tool for investigating RNA conformation, which cannot be achieved with hybridization.
Second, we analyzed the structural elements of steroid receptor RNA activator (SRA) RNA and suggested a new RNA inhibitor on estrogen receptor alpha (ER $\alpha$) signaling in breast cancers. SRA is an RNA regulator that coactivates steroid receptor-mediated transcription. It is a putative coactivator in the estrogen receptor (ER) signaling pathway. It functions as an RNA molecule itself, but its isoform can encode a protein. SRA levels are elevated in the majority of tumors. Regulatory actions of noncoding SRA core RNA vary depending on the type of estrogen receptors, the presence or absence of ligand, and even reporter elements. Recently it was reported that SRA RNA can be dissected into four domains based on various probing experiments. In this study, we examined the contribution of domains or helices to its coactivation ability to understand the role of structural elements of SRA RNA essential for the RNA function. We showed that domain III played a crucial role in SRA RNA. Furthermore the domain specifically inhibits ER $\alpha$ -dependent transactivation as a competitive inhibitor by interfering with the interaction between coactivators and SRA RNA. In particular four helices, H15 to H18 among nine helices of the domain III showing significantly high sequence conservation across vertebrates also inhibited the ER $\alpha$ signaling pathway. Taken together, the results gave an insight into structural basis for a role of SRA RNA with the estrogen and ER complex and proposed a new target candidate on RNA therapeutics in breast cancers.
In summary, this thesis proposed a novel tool for recognizing RNA conformation and dissecting RNA structural motifs. Also we investigated the contribution of structural elements of SRA RNA in breast tumors. In that molecular architecture plays a key role in understanding the mechanism of many functional RNAs, these studies of functional dissection can pave the way for gaining extensive insights on RNA field as well as application to develop new diagnostic and therapeutic approaches for RNA-related diseases.
최근 연구결과에 따르면 RNA는 다양한 세포 대사과정을 조절하며, 암이나 다른 질병들의 발병과정에도 참여하고 있음이 밝혀지고 있다. 이런 생물학적 기능은 서열이 결정적인 역할을 할지라도, 3차원적인 구조에 의존한다. 그러므로 세포 내에서 RNA에 대한 구조 분석은 그 기능을 이해하는데 있어서 필수적이다.
이에 첫째로, RNA를 인식하는 항체를 이용하여 RNA 구조를 인지하고 분석하는 방법을 고안하였다. 패닝이라는 스크리닝법과 친화도 성숙과정을 통해 인간 항체 라이브러리에서 RNA에 결합하는 항체를 선별할 수 있는 방법을 확립하였다. 항원으로 사용한 BC200 RNA는 뉴런에서 최초로 발견되어 시냅스에서 국지적인 단백질 발현을 조절하지만, 최근 침습성이 강한 유방암에서도 발현양이 많은 것으로 확인되었다. 본 학위논문에서는 패닝과 친화도 성숙과정을 통해 최종적으로 해리상수가 약 7 nM인 MabBC200-A3이라는 항체를 선별하였으며, BC200 RNA의 두 부분(76번~85번, 96번~104번)에 특이적으로 결합함을 밝혔다. 이에 본 항체를 이용하여 다양한 유방암 세포주에서 면역분석법을 수행하였으며, 기존의 접합법(hybridization)과 비교해보았다. 결과적으로 세포에서 RNA를 추출하고 항체로 면역침강하여 얻은 세포주별 BC200 RNA의 상대적인 양이 기존의 방법을 사용하여 얻은 양과 패턴이 동일함을 확인하였다. 더불어 세포 내에서 가장 비슷한 구조를 가진 7SL RNA를 구별할 수 있었는데, 이는 곧 항체가 특이적인 검출체로써 활용될 수 있음을 의미한다. 흥미롭게도 추출한 RNA를 면역침강하는 대신 세포 내로 항체를 투과시켜서 측정한 BC200 RNA의 상대적인 양은 기존의 방법에서 분석한 양상과 달랐는데, 이는 세포 내에 적어도 두 가지 형태의 BC200 RNA(항체에 의해 인지되는 BC200 RNA와 그렇지 않은 BC200 RNA)가 존재함을 시사한다. 이런 차이는 항체에 의해 인식되는 영역의 보존 정도나 항체의 접근성에 의해 결정될 것이다. 결과적으로 기존의 접합법과는 달리, RNA를 인식하는 항체가 RNA의 구조를 탐구할 수 있는 새로운 툴로써 활용될 수 있을 것으로 예상된다.
둘째로 스테로이드 수용체 RNA 활성인자(SRA RNA)의 구조적 분할 분석을 수행하였고, 유방암 세포에서 에스트로겐 신호 전달을 저해 할 수 있는 새로운 RNA 억제제를 제안하였다. SRA는 스테로이드 수용체 매개의 전사반응을 조절하는 RNA이다. 에스트로겐 수용체 신호 전달에서 보조활성인자의 역할을 하며, RNA 자체로 기능할 뿐만 아니라 단백질을 코딩하는 것으로도 알려져 있다. 또한 유방암이나 대장암 같은 호르몬 이상과 관련된 암에서도 과발현되며, 에스트로겐 수용체 종류, 에스트로겐의 유무 및 DNA 결합부위에 따라 기능이 달라진다. 최근 다양한 구조 탐사법에 의해 SRA RNA가 4개의 도메인으로 구성되어 있음이 밝혀졌다. 이에 보조활성기능에 필수적인 영역을 찾고 그 역할을 이해하고자, 각 도메인 및 나선의 역할 기여도를 분석하였다. 그 결과, 도메인 3이 중요한 영역임을 발견하였다. 더불어 다른 보조활성인자와 SRA RNA의 결합을 방해함으로써 에스트로겐 수용체 매개의 전사반응을 저해할 수 있음을 밝혔다. 특히 도메인 3의 9개 나선 중 15번 나선부터 18번 나선에 이르는 부분은 그 서열의 보존성이 척추동물에서 매우 높으며, 도메인 3처럼 해당 전사반응을 억제하였다. 결과적으로 본 연구는 SRA RNA의 기능을 구조적인 관점에서 분석하였으며, 유방암 치료에 활용될 수 있는 RNA 억제제를 제시하였다는 점에서 의의가 있다.
요약하자면, 본 학위논문은 RNA 구조를 인지하고 분할 분석할 수 있는 새로운 툴을 제안하였다. 또한 유방암에서 SRA RNA 구성 요소의 기능적 기여도를 밝혔다. RNA의 기능을 분석하는데 있어 분자 구조를 이해하는 것은 중요하기 때문에, 본 학위논문에서 수행된 기능적 분할 분석은 학술적인 측면에서 RNA 연구에 새로운 시야를 제공할 것이며, 응용적 측면에서도 RNA와 연관된 질병들의 새로운 진단 및 치료제 개발에서 중요한 역할을 할 것으로 기대된다.
