In recent years, the most significant development in the field of synthetic organic chemistry is the application of enzymes to chemical reactions. Reactions catalyzed by enzymes or enzyme-containing microorganisms display greater specificities than conventional organic reactions. Some of these reactions have already been shown to have useful applications in the fields of synthetic organic chemistry and biotechnology, especially for the preparation of pharmaceuticals, fine chemicals, food additives and commodity chemicals.
In this thesis, new chemo-enzymatic processes for chiral ester compounds were described. First, a novel and efficient resolution process for methyl (R)-2-chloromandelate, the key intermediate for the synthesis of (S)-clopidogrel ($Plavix^R$), has been developed by CAL-A catalyzed transesterification reaction using vinyl propionate as acyl donor with or without organic solvents. The data showed that a CAL-A-catalyzed resolution of methyl 2-chloromandelate, which has steric effect on enzymes is feasible by performing a transesterification reaction in organic solvents with vinyl propionate. Under optimized condition, methyl (R)-2-chloromandelate of high optical purity (>99% ee) was successively prepared in good yield (42%) and high enantioselectivity (E = 34.7). The immobilized enzyme, CAL-A, was reused thirteen times without loss of enantioselectivity and reactivity. It is economical and easy to scale-up for commercial production of mehyl (R)-2-chloromandelate. Several useful chiral intermediates with high optical purity (>99% ee) could be synthesized using this methyl (R)-2-chloromandelate.
Second, enzymatic synthesis of chiral $\beta$ -hydroxy-$\alpha$ -amino acids having two chiral centers and three carbon atoms with different functional groups was attempted. These compounds are used as valuable intermediates for the synthesis of chiral pharmaceuticals such as $\beta$ -penem antibiotics. In this study, twenty-two microbial keto reductases/GDH enzymes were tested for reduction of ethyl 2-acetamido-3-oxobutanoate synthesized from ethyl acetoacetate to ethyl D-threonine. A glucose dehydrogenase-coupling reaction was used to regenerate NAD(P)H to perform the reduction reaction continuously. Four keto reductase showed high enantioselectivity and activity. Candida magnolia keto reductase, Candida parapsiliosis keto reductase, and Rhodococcus erythropolis keto reductase produced ethyl D-threonine and ethyl L-allo-threonine, whereas Devosia riboflavin keto reductase produced ethyl L-threonine and ethyl D-allo-threonine. Among four keto reductases screened, Rhodococcus erythropolis keto reductase was extensively studied because it produced ethyl D-threonine predominantly. This enzyme used $NAD^{+}$ as cofactor. The optimum temperature was $20^\circ C$ and optimum pH was 6.5. The keto reductase activity was increased somewhat by the ionic salts such as $Mg^{2+}$ and $Ca^{2+}$. Large scale production (up to several hundreded grams) of ethyl D-threonine and ethyl L-allo-threonine was carried out using Rhodococcus erythropolis keto reductase with good yield (92% yield).
최근에 합성 유기화학 분야에서 가장 주요한 발전은 효소를 화학반응에 적용하기 시작한 것이다. 효소 혹은 미생물에 의해 수행되는 반응은 기존의 유기반응보다 특이성이 매우 높다. 이러한 반응의 일부는 이미 합성유기화학 특히 의약품, 정밀화학제품, 그리고 식품 첨가물이나 범용제품에까지 적용되고 있다. 이 논문에서는 새로운 효소/화학적 공정으로 유용한 키랄 알코올 화합물을 제조하는 연구 결과에 대해 서술 하고자 한다.
첫번째로, 시장이 매우 큰 혈전용해제인 클로피도그렐 (상품명:플라빅스)을 합성하는데 주요한 중간체인 methyl (R)-2chloromandelate를 경제적으로 제조할 수 있는 새로운 공정을 개발하였으며, 이 공정은 유기용매를 사용하지 않고, vinyl propionate를 acyl donor로 사용하고 효소 CAL-A를 촉매로 사용하여 transesterification 반응을 시켜 제조하는 공정이다. 최적화된 조건에서 반응 시켜, >99% ee의 고광학순도 제품을 42% 의 고수율로 제조했으며, E=34.7의 높은 enantioselectivity를 보였다. 고정화된 CAL-A 효소는 13번을 반복 사용하여도 활성이나 enantioselectivity가 유지되었다. methyl (R)-2-chloromandelate를 상업생산하기 위해 경제적이고 용이하게 scale-up시킬 수 있다. 높은 광학순도 가지는 methyl (R)-2-chloromandelate를 이용하여 다른 유용한 키랄 화합물을 제조하는 것도 가능하다.
두번째 연구내용은 chiral $\beta$ -hydroxy- $\alpha$ -amino acids 제조방법에 관한 것이며, 이 화합물은 2개의 chiral centers를 갖고 있으며, 다른 3개의 반응기를 갖고 있기에, $\beta$ -페넴 항생제를 포함한 키랄 의약품 합성에 유용한 화합물이다. 본 연구에서는 22가지의 미생물 유래 재조합 효소인 keto reductase/GDH를 합성기질인 ethyl 2-acetamido-3-oxobutanoate에 반응시켜 D-threonine 에틸 에스터를 제조하였다. 환원 반응을 계속 돌리기 위해서는 NAD(P)H를 계속 재생산 해야 하며, 이를 위해 glucose dehydrogenase를 사용하였다. 22 효소중 4가지가 높은 활성과 입체 특이성을 보였다. Candida magnolia, Candida parapsilosis, Rhodococcus erythropolis 유래 keto reductase가 D-threonine ethyl ester와 L-allo-threonine ethyl ester로 환원 시켰으며, Devosia riboflavin 유래 keto reductase가 L-threonine ethyl ester와 D-allo-threonine ethyl ester로 환원시켰다. 4 가지 효소중 D-threonine ethyl ester쪽으로 많이 반응시키는 Rhodococcus erythropolis 유래 keto reductase를 선택하여 특성을 연구하였다. 그 결과 이 효소는 가격이 상대적으로 저렴한 $NAD^{+}$ 를 cofactor로 사용하고, 최적온도는 $20^\circ C$, 최적 pH는 6.5임을 밝혀내었다. 또한 $Mg^{2+}$, $Ca^{2+}$ 등의 양이온을 첨가하면 반응이 빨라지는 것도 밝혀냈다. 정해진 반응조건 에서 400 g 기질을 효소반응시켜 92%의 수율로 D-threonine ethyl ester와 L-allo-threonine ethyl ester를 제조하였다. 산물을 HCl로 가수분해시키고 아미노산 분석용 HPLC로 분석해 D-threonine과 L-all-threonine이 81:18% 의 비율로 제조된 것을 확인하였다. 이를 재결정 시키면 D-threonine을 깨끗하게 정제해 낼 수 있다.
