Microalgal hydrolysate, an alternative carbon source, could be used as a feedstock for the production of valuable bioproducts such as biofuel and biochemicals. The acid hydrolysate of Nannochloropsis oceanica contains 7 different sugars of glucose, galactose, xylose, rhamnose, ribose, mannose and fucose. At first, DagA, a β-agarase was produced by cultivating a recombinant Streptomyces lividans in a glucose medium or a mixed-sugar medium simulating microalgae hydrolysate. The optimum composition of glucose medium was identified as 25 g/L glucose, 10 g/L yeast extract, and 5 $g/L MgCl_2·6H_2O$. With this, a DagA activity of 7.26 U/mL was obtained. It was tried to produce DagA in mixed-sugar medium mimicking N. oceanica hydrolysate. When a mixed-sugar medium containing 25 g/L of sugars was used, a DagA activity of 4.81 U/mL was obtained with very low substrate utilization efficiency due to the catabolic repression of glucose against the other sugars. When glucose and galactose were removed from the medium, an unexpectedly high DagA activity of about 8.7 U/mL was obtained even though a smaller amount of sugars were used. It is recommended for better substrate utilization and process economics that glucose and galactose should be eliminated from the medium being consumed for some other useful applications before the production of DagA.
A novel two-step fermentation process based on sequential utilization of sugars in the mixed-sugar medium has been proposed. In the first step, glucose was consumed by Saccharomyces cerevisiae together with galactose and mannose producing ethanol. In the second step, DagA was produced by the recombinant S. lividans from the residual sugars of xylose, rhamnose and ribose. Fucose was not consumed. By adopting this two-step process, the overall substrate utilization efficiency was increased approximately 3-fold with a nearly 2-fold improvement of DagA production, let alone the additional benefit of ethanol production.
Afore-mentioned two-step fermentation process was studied by using real microalgal hydrolysate. To prepare microalgal hydrolysate, 100 g/L lipid-extracted N. oceanica biomass was treated with 1.5 N $HNO_3$ or $H_2SO_4$ at 120 ℃ for 60 min. The N. oceanica hydrolysate treated by nitric acid was desalted by electrodialysis. When a membrane with a molecular weight cut-off of 300, about 98 % salts were removed from N. oceanica hydrolysate. Although, the total salt concentration was low enough, yeast cells in the first stage did not show a substantial level of growth probably due to still remaining inhibitory compounds. The N. oceanica hydrolysate treated by sulfuric acid was neutralized with $CaCO_3$. In this step, sulfate was removed in the form of gypsum. The treated hydrolysate containing total 7.01 g/L of 7 different monosugars: 2.19 g/L glucose, 1.12 g/L galactose, 1.32 g/L mannose, 0.47 g/L xylose, 0.50 g/L rhamnose, 0.86 g/L ribose and 0.55 g/L fucose was used for the sequential production of ethanol and DagA. In the first step, 1.30 g/L of ethanol was produced by S. cerevisiae with complete utilization of glucose, galactose and mannose. In the second step, 3.6 U/mL of DagA was produced by S. lividans with complete utilization of the residual sugars except fucose. Consequently, an overall substrate utilization of as high as 92.2 % was obtained. The unconsumed fucose has a potential to be a high-value-added product with many applications once recovered.
미세조류는 빠른 성장 및 비교적 높은 지질 함량의 특성으로 에너지 연료의 대체 물질로 많은 관심을 얻고 있다. 일반적으로 지질을 추출하고 남은 미세조류 바이오 매스는 대부분 버려지거나 비료 또는 가축의 사료로 사용되었다. 하지만 최근에는 미세조류 바이오 매스를 가수분해 하여 발효의 원료 당으로 이용하는 연구들이 활발히 진행되고 있다. 미세조류는 세포 내에 영양분을 축적한다. 이러한 미세조류를 가수분해 하면 glucose, galactose, xylose, mannose, rhamnose, ribose arabinose 그리고 fucose 등 최대 8 가지 당을 얻을 수 있다. 하지만 대부분의 균주 들은 동시에 여러 당을 소모할 수 없다. 이러한 제한된 기질 활용 문제를 극복하기 위해, 여러 당을 동시에 소모할 수 있는 균주의 선정이 필요했다. Streptomyces lividans 는 이러한 목적에 적합한 균주이다. 이들은 fucose 를 제외하고, 미세조류 당화 액 내의 대부분을 당을 소모 할 수 있다. 이러한 이유로 본 연구에서는 DagA 생산에 glucose 대신 미세조류 당화 액을 모사한 혼합당을 탄소 원으로 사용하였다. DagA 는 Streptomyces coelicolor 에서 유래한 베타 아가레이즈 이며, Streptomyces lividans 에 클로닝하여 과발현되었다. 하지만 이러한 Streptomyces 균주는 일반적으로 영양이 매우 풍부하고 복잡한 배지에서 자라는 특성이 있어, 대량의 효소 생산 목적으로 사용하기에는 경제적으로 부적합하다. 이러한 이유로, 용이한 연구를 위하여 단순하고 저렴한 glucose 배지를 개발하였다. DagA 생산에 큰 영향을 미치는 영양분을 Plackett Burman design(PBD) 을 통하여 선정하였고, 중심합성법(CCD) 에 기초한 반응표면법(RSM) 으로 최적 농도를 선정하였다. 이렇게 통계적 방법으로 최적화한 배지는 glucose 25 g/L, yeast extract 10 g/L 그리고 $MgCl_2·6H_2O$ 5 g/L 로 이루어져 있다. 이 배지를 통해 7.26 U/mL 의 DagA 활성을 얻을 수 있다.
Nannochloropsis oceanica 를 산으로 당화한 용액에는 glucose, galactose, xylose, rhamnose, ribose, mannose 그리고 fucose 이렇게 7가지의 당이 포함되어 있다. 일단, 최적화한 glucose 배지와 혼합당을 사용한 배지에 재조합 한 Streptomyces lividans 를 배양하여 DagA 를 생산하였다. 25 g/L 의 당으로 이루어진 혼합당을 사용하였다. Glucose 에 의한 기질 저해 효과에 의해 매우 적은 기질 활용 효율과 함께 4.81 U/mL 의 DagA 활성을 얻었다. Galactose 는 DagA 의 성장에만 약간의 영향을 미칠 뿐, 효소생산에는 별다른 영향을 주지 않는 것으로 밝혀졌다. Glucose 와 galactose 를 제거한 후, 훨씬 적어진 당량에도 불구하고, 예상과 다르게 비교적 높은 8.6 U/mL 의 DagA 활성을 얻을 수 있었다. 또한 기질 활용 효율도 증가하였다. 이러한 결과를 통해 혼합당으로부터 DagA 를 생산할 때는 기질활용효율을 높이고, 경제적인 공정이 가능하도록 glucose 와 galactose 가 먼저 제거된 후에 DagA 를 생산하는 것이 훨씬 유리하다는 것을 알아냈다.
혼합당으로부터 DagA 를 생산할 때, 기질 활용 효율뿐 아니라, DagA 생산 효율을 향상시키기 위하여 새로운 기질활용 전략을 세웠다. 새로운 전략에서, 첫 번째 단계로 glucose, galactose 및 mannose 는 이스트 배양을 통해 에탄올로 전환시킨다. 이때 사용하는 이스트는 Saccharomyces cerevisiae KL17 로 galactose 를 glucose 만큼 잘 소모할 수 있는 균주이다. 두 번째 단계로 남아있는 당으로부터 Streptomyces lividans 배양을 통해 DagA를 생산한다. 이렇게 얻은 최고 DagA 활성은 8.9 U/mL 이며, 92.6 % 의 기질활용 효율을 가진다. 따라서, 이러한 순차적 기질활용 공정을 통하여, 혼합당으로부터 DagA 를 한 단계로만 생산하는 경우에 비해 약 3배 향상된 기질활용 효율, 약 2배 가량 향상된 DagA 활성을 얻을 수 있으며, 부가적으로 6.3 g/L 의 에탄올도 얻을 수 있다.
본 연구의 최종 목표는 실제 Nannochloropsis oceanica 산 당화 액으로부터 에탄올과 DagA 를 생산하는 것이다. 전체 공정은 세 단계로 구성되어있다. 첫 번째 단계에서 100 g/L 의 지질추출 된 Nannochloropsis oceanica 를 1.5 N 질산 또는 황산으로 121 ℃ 에서 60분 동안 산 당화 한다. 두 번째 단계로, NaOH 와 $CaCO_3$ 로 중화하고, 전기투석장치를 이용하여 용액 내에 남아있는 염을 제거한다. 마지막 단계로, 염이 제거된 당화 액 으로부터 에탄올과 DagA를 생산한다. 질산으로 당화한 Nannochloropsis oceanica 당화 액 내의 염은 AC220-550 멤브레인 카트리지를 사용하여 약 98 % 가량 제거되었다. 하지만 이 당화 액에서 이스트가 자라지 못했다. 아직 밝혀지지 않은 저해 물질로 인한 것이라 추측된다. 황산으로 당화한 Nannochloropsis oceanica 당화 액의 경우 $CaCO_3$ 로 중화하는데, 이 때 생성되는 짚섬으로 인해 대부분의 염이 제거되므로 별도로 탈염과정을 거치지 않는다. 이 당화 액 내에 전체 7.01 g/L 의 7가지 당이 포함되어있다. 2.19 g/L glucose, 1.12 g/L galactose, 1.32 g/L mannose, 0.47 g/L xylose, 0.50 g/L rhamnose, 0.86 g/L ribose 그리고 0.55 g/L fucose 가 에탄올과 DagA 생산에 사용되었다. 1 단계에서, 1.30 g/L 의 에탄올이 glucose, galactose 및 mannose 로부터 S. cerevisiae 에 의해 생산되었고, 2 단계에서, 3.6 U/mL 의 DagA 활성이 xylose, rhamnose 및 ribose 로부터 S. lividans 에 의해 생성되었다. Fucose 는 소모되지 않았고 결과적으로 92.2 % 기질활용효율을 얻었다.
Fucose는 그 자체로 매우 고부가가치를 가지는 물질로 사용될 수 있는데, 소모되지 않고 당화 액 내에 남아있는 fucose 는 분리정제가 용이하다는 공정상으로 또 다른 장점으로 작용할 수 있다. Fucose 는 노화방지 제품의 활성성분, 장기 기억력 상승 유도물질, 알레르기성 피부염 억제 제 등으로 사용될 수 있는 가능성을 가지고 있다.
