A large number of site-specific restriction endonucleases have been isolated from a wide variety of microorganisms because of their extensive usefulness in the structural analysis of DNA molecules, and for the construction of recombinant DNA $\underline{in} \underline{vitro}$.
Through this thesis, I present a procedure of purification of restriction endonuclease AccI from $\underline{Acinetobacter} \underline{calcoaceticus}$ ATCC 23055. I also describe the determination of physical and catalytic properties of this enzyme.
For the purification of the enzyme, 300 g cells of wet weight were used and were broken by French press at 20,000 p.s.i.. After ammonium sulfate fractionation, the enzyme was further purified by heparin agarose column chromatography, DEAE-sephadex A-50 column chromatography, Affi.- Gel Blue column chromatography, phosphocellulose column chromatography, and finally hydroxyl apatite column chromatography. The isolated enzyme has shown to have site-specific restriction endonuclease activity on the AccI recognition sequence which has a degeneracy i.e., : d (5'-G-T-A-T-A-C-3') or d(5'-G-T-C-G-A-C-3'). AccI endonuclease has a single polypeptide species and its molecular weight of subunit was 45,000±1,000 daltons, as judged by 10% polyacrylamide gel electrophoresis in the presence of 0.1% sodium dodecyl sulfate.
In order to study the catalytic properties of AccI endonuclease, I was used ($^3H$)-labeled DNA by HpaII methylase as substrate. The enzyme showed maximum activity at pH values between 8.0 and 11.0, and in the presence of 5.0 to 20.0 mM magnesium chloride. But AccI endonuclease did not require salt (NaCl) and 2-mercaptoethanol for its activity. Furthermore the enzyme retained its maximum activity to the concentration of 100 mM sodium chloride and to the concentration of 300 mM 2-mercaptoethanol.
많은 종류의 염기서열 특이한 제한효소가 DNA 분자의 구조적 분석과 실험실 에서의 DNA 재조합 등에 광범위하게 이용될 수 있기때문에 다양한 미생물로 부터 분리, 정제되고 있다. 특히 type II 제한효소는 크기가 작고, 안정하며, 효소의 활성도를 위해서 요구 하는 것이 간단하고, DNA 이중 나선상 에서 염기서열을 특이하게 인식하는 성질을 보이고 있어서, 분자 생물학에서 해결되어야 할 과제인 DNA 와 단백질 간의 상호작용을 연구 하는데 이상적인 모델 시스템이 되고 있다. 이러한 연구에 사용되기 위해서는 보다 순수한 효소의 정제가 절대적으로 필요하다. 따라서 본 실험실 에서는 $\underline{Acinetobacter} \underline{calcoaceticus}$로 부터 제한효소인 Acc I 을 순수하게 분리하는 방법을 개발하였으며 동시에 분리된 효소의 물리적, 촉매적 성질도 결정하였다.
효소를 분리하기 위해서 300g의 $\underline{A}. \underline{calcoaceticus}$를 얻어, French press 로 20,000 p.s.i. 에서 깬 다음 ammonium sulfate 분리를 거쳐 heparin-agarose, DEAE-Sephadex, Affi.-gel blue, phosphocellulose, hydroxyl-apatite 의 순서로 chromatography를 수행하였다. 위의 과정을 통하여 분리된 효소는 거의 다른 효소가 제거된 순수한 효소임을 ligation-recutting 실험으로 부터 알 수 있었다. 이 효소는 0.1% SDS 를 포함하는 polyacrylamide gel 상에서 전기 영동한 결과 45,000 ± 1,000 의 분자량을 보여 주었다.
Acc I 제한효소는 d(5'-G-$T^{\downarrow}$-A-T-A-C-3') 혹은 d(5'-G-$T^{\downarrow}$-A-T-A-(3') 의 염기 서열을 인식하여 짜른다. 그러므로 pUC9 과 SV 40 DNA 에서는 한 개의 절단 부위를, pBR 322 와 ΦX 174 DNA 에서는 2 개,λ DNA 에서는 9 개의 절단 부위를 갖게 된다.
정제된 효소의 촉매적 성질을 알아보기 위해서 Hpa II 변형 효소에 의해 ($^3H$) 이 붙여진 λ DNA를 기질로 사용 하였다. Acc I 제한효소는 pH 8.0 에서 11.0 사이에, 5.0 에서 20 mM까지의 $MgCl_2$ 농도에서 최대의 활성을 보였다. 그러나 NaCl 과 2-mercaptoethanol 은 효소 활성을 위해서 요구되지 않았다. 뿐만 아니라 이 효소는 NaCl 에 대해서는 100 mM 까지, 2-mercaptoethanol 에서는 300 mM까지의 광범한 농도에 대해서도 최대의 활성을 유지하였다.
