The natural polymers display multiple advantages over synthetic polymers for biomedical applica-tions including hydrogel formation and surface modification with respect to their often inherent biocompati-bility, biodegradability, and good cell adhesion properties. However, it has been prepared by partial chemical tethering of thiol-, aldehyde-, dihydrazide-, and methacrylate-containing moieties for hydrogel formation. Different strategies (e.g., conjugation of additional functional groups in natural polymer) have also been ar-ranged for surface immobilizations. Therefore there needs to be more simple methods which could perform both hydrogel formations and surface modifications.
Mussels as the underwater creatures which attach to solid surfaces in the sea, their adhesion is rap-id, strong, and tough to such an extent as to endure the next incoming waves. Therefore, adhesion property of mussels has received considerable attention as methods for chemical modification of multifunctional poly-mer introduction on bulk material surfaces to develop the biocompatible, adhesive medical devices. Blue marine mussel (Mytilus edulis) secretes adhesive proteins, called Mytilus edulis foot protein (Mefp), which have an unusual amino acid, 3,4-dihydroxy-L-phenylalanine (DOPA). The major driving forces of mussel adhesion are related to catechol groups of DOPA showing the superior adhesiveness to various materials in-cluding rocks, ships, Teflon (Polytetrafluoroethylene) and even biomacromolecules. Importantly, mussel ad-hesive proteins contain the positively charged residues (e.g., Lys, His) that show the lack of negatively charged residues. It is noted that amine groups are co-contributed with the catechol groups to mussel adhe-sion via covalent/non-covalent reactions such as Michael-type addition reactions, Schiff-base formations, and π-cation bonds. Thus, catechol and amine groups are significant elements to enhance the under-water adhesion.
The chemical structure of dopamine with catechol and amine groups, which similar to that of DOPA in mussels composes structural domain essential for its adhesive properties. The dopamine spontaneously progress the oxidation reaction, and then self-polymerize to produce thin layers (i.e. polydopamine films) on the organic or inorganic materials. That polydopamine method to form material-independent and multifunc-tional coating has been expended as a means to overcome the limits of adhesion in various areas. Therefore, the natural polymers with catechol moieties which are derived from dopamine might be superior to the ones without catechol moieties in adhesion (i.e., surface modification) and biological effects. And it is possible to get hydrogel network which has more resistant to mechanical forces through chemical cross-linking between catechol moieties on natural polymers.
Inspired by mussel adhesion behaviors, we synthesized a multiple catechol groups-conjugated chi-tosan (CHI-C) and hyaluronic acid (HA-C) to fabricate the biocompatible, adhesive medical devices. The synthesis protocol was well-organized to prevent the spontaneous oxidation of catechol groups and for scale-up supplying for the commercial, medical products. The catechol groups in chitosan and hyaluronic acid backbone served as inter-molecular crosslinker and adhesive moieties. In thesis dissertation, we introduce the biomedical applications using CHI-C and HA-C in adhesive hydrogels, and hybrid hydrogels as drug carrier. In addition, a novel surface modification method that we have developed for mimicking microenvironments of vascular endothelium using catechol-conjugated polymer, and for surface bioconjugation and functionali-zation using native chemical ligation are also demonstrated.
The first part (Chapter 2) is development of a method for preparing catalyst-free hydrogels by uti-lizing surface-immobilized catalyst and catechol-conjugated polymers. One of the most challenging problems is the unavoidable incorporation of non-biological catalysts. Examples include the incorporation of Cu (I), periodate, FeCl3, or enzymes within three-dimensional polymeric networks of hydrogels. Catalysts encapsula-tion or incorporation has been a significant problem in Food and Drug Administration (FDA) permissions for human trials. Here, we introduce an entirely new method for forming hydrogels, wherein the formation is trig-gered by a catalyst, but the resulting hydrogels are catalyst-free. We unexpectedly found that sufficient amount of crosslinkable catecholquinone/semiquinone free radicals is generated by physical contact between catechol-containing polymers (i.e., CHI-C) and surface-immobilized catalysts (i.e., hematin). A contact time of 1 min between the CHI-C solution and the immobilized hematin results in the solution becoming a hydro-gel within 30 min after injection. This approach is notably different from previously studied catalyst-mediated hydrogels in that the method described herein generates chemically active intermediates which ki-netically react with the polymer molecules being hydrogels at a later time point in the absence of the catalyst molecules. This mechanism allows the fabrication of catalyst-free hydrogels. Thus, this new chemical method for preparing hydrogels can provide an effective way of reducing potential toxicity for a variety of medical settings and ultimately for human trials and regular use.
The second part (Chapter 3) is a new role for graphene oxide (GO) in hybrid hydrogels in which GO is present in the hydrogel network and demonstrate enhancement of small drug loading. Hydrogels have been widely investigated as depots and carriers for drug delivery. For example, hydrogels have been successfully used to encapsulate a variety of pharmaceuticals, such as peptides and proteins. Recently, carbon materi-al/hydrogel hybrid systems have been of interest as new hydrogel systems because of the attractiveness of structural reinforcement for biomedical applications. In particular, graphene and GO have been recognized as novel biomaterials with unique physical, electrical, and thermal properties. Among the various applications of these materials, many research groups are intensively exploring the biomedical applications of graphene and GO. In this study, we propose a new role for GO in hybrid hydrogels, with the inclusion of GO in the gel net-work resulting in a nearly 90% enhancement in the loading of small, hydrophobic drugs (e.g., doxorubicin, Dox) compared to the hydrogel without encapsulated GO. The hydrogels were prepared from hyaluronic acid (HA), with a mussel-inspired crosslinking chemistry used to prepare the HA hydrogels. Dox was then loaded into the hydrogels. The HA/GO composite hydrogel not only enhanced the loading amount but also exhibited long-lasting anticancer activity over 10 days. We believe that these graphene oxide-containing composite hydrogels can solve one of the challenges in the application of hydrogels by improving the loading efficiency of small-molecule drugs.
The third part (Chapter 4) is development of an inner surface modification of fluidic channels which could resist flow shear stress for mimicking microenvironments of vascular endothelium. In vascular tissue engineering, surface modification to mimic in vitro realization of cellular microenvironment is consid-ered to be an effective strategy to improve endothelialization. In particular, environment of the endothelium in blood vessels is constantly under strong shear force. Thus, adsorption of macromolecular extracellular ma-trices (ECMs) onto synthetic polymeric surfaces within fluidic channels often results in rapid desorption of the adhered ECM molecules and attached cells. Also, surface treatments such as plasma oxidation or laser for subsequent silanization are often not effective methods for 3D channel modifications with biomacromole-cules. This study reports a new, alternative method of using a water-resistant adhesive polysaccharide. Intro-duction of adhesive properties is inspired by the catechol chemistry utilized in marine mussels, in which bioac-tive hyaluronic acid is chemically modified into HA-C. The HA-C exhibited enhanced ability of surface bind-ing under a shear force condition compared to unmodified HA. HA-C was able to retain the adhered of endo-thelial cells under fluid shear stresses up to 150 dyne/cm2, but the HA (unmodified) showed rapid detachment of the adhered cells even under low shear force condition of about 50 dyne/cm2. This is the first study demonstrating practical utility of the catechol mediated adhesive chemistry because a large body of previous studies using catechol containing polymers, and so on has demonstrated the adhesive property of catechol only in static conditions. The HA-C compound developed herein provides a straightforward strategy for im-proving stability in surface retention and preventing substantial tissue damage from the fluctuating blood flow after vascular reconstructive surgery. Moreover, the strong adhesiveness of HA-C could have an impact on designing bioreactors with controlled microenvironments that deliver well-defined, functional, tolerable surfaces upon various velocities and shear stresses shown in physiological conditions
Finally, we have developed a method for surface bioconjugation and functionalization which use novel chemical reaction on surfaces (Chapter 5). Native chemical ligation (NCL) is an emerging chemoselec-tive chemistry that forms an amide bond by trans- thioesterification followed by intramolecular nucleophilic rearrangement between thioester and cysteine. The reaction is simple, occurs in a mild aqueous solution, and gives near-quantitative yields of a desired product. Since the first report in 1994, most studies involving the use of NCL have focused on the total synthesis of proteins to address fundamental questions pertaining to many aspects of protein science, such as folding, mirror images, and site-specific labeling of proteins, but ap-plications of the NCL reaction for other areas remain largely unexplored. Herein, we present a facile strategy for surface immobilization of poly(ethylene glycol) (PEG) utilizing the NCL reaction. Surface immobilization of PEG (i.e., PEGylation) plays a key role in preventing nonspecific protein adsorption on surfaces, which is crucial in a wide variety of medical devices. Using cysteine-PEG and thioester- containing phosphonic acid conjugates, we achieved efficient surface PEGylation on titanium surfaces. This study indicates that the NCL reaction will be a useful toolkit for surface bioconjugation and functionalization.
천연고분자는 합성고분자에 비해 고유의 생체 적합성, 생분해성, 그리고 좋은 세포 부착 특성을 갖고 있기 때문에 하이드로젤 형성과 표면개질과 같은 생체의학 분야 응용에 여러 장점을 갖고 있다. 하지만 천연고분자 하이드로젤을 형성하기 위해서는 티올 (thiol), 알데히드 (aldehyde), 다이하이드라자이드 (dihydrazide), 그리고 메타크릴레이트 (methacrylate) 등을 포함한 추가적인 작용기의 도입이 필요하다. 또한 천연고분자의 표면고정화를 위해서는 또 다른 화학적 작용기가 도입되어야 하기 때문에, 이를 동시에 수행할 수 있는 작용기를 천연고분자에 도입하는 방법에 대한 연구가 필요하다.
바다홍합 (mussel)은 수중 환경에서 바위, 이끼, 수초와 같은 다양한 유무기 물질에 강하게 붙어서 자라는 수중 생물이다. 또한 홍합은 일반적으로 실생활에서 사용되는 본드나 테이프 등이 물에 접촉하였을 때 접착성을 잃어버리는 것과 달리 수중 환경에서 강한 접착력을 가지기 때문에 연구 대상으로 많은 관심을 받고 있다. 홍합의 접착능력은 접착섬유실을 구성하는 단백질 조성을 통해 밝혀진 특이적인 아미노산인 도파 (DOPA, 3,4-dihydroxyphenylalanin)에 기인하는 것으로 보고되었다. 이러한 홍합의 접착단백질은 표면에 물질이 잘 달라붙지 않는 것으로 알려진 폴리테트라플루오로에틸렌 (polytetrafluoroethylene, PTFE)을 비롯하여, 금속, 비금속, 유기 고분자, 무기물질 등의 대부분의 표면에서 모두 강한 접착력을 가지는 것으로 알려져 있다.
홍합의 접착 단백질에서 접착력에 중요한 역할을 하는 것으로 알려진 도파의 화학적 작용기인 카테콜 (catechol)과 아민 (amine)으로 구성된 단분자 물질인 도파민 (dopamine)을 이용한 재료 비특이적 표면개질법 (material-independent surface modification)이 보고되었다. 이를 통해 물질의 표면에 카테콜아민의 산화에 의한 폴리도파민 (polydopamine, pDA) 코팅 층을 형성시켜 표면 부착능력을 부여할 수 있었을 뿐만 아니라, 폴리도파민 표면개질은 그 자체의 화학적 성질에 의한 2차 표면개질을 가능하게 하였으므로 이를 바탕으로 다양한 응용 연구가 진행되고 있다.
이에 본 연구에서는 홍합의 접착 작용기인 카테콜을 화학반응을 통해 천연고분자에 도입하여 생체적합성을 갖는 의료기기 개발을 위한 표면개질연구와 하이드로젤 형성연구를 진행하였다. 이에 따라 생체 친화적 고분자인 키토산 (chitosan)에 카테콜기를 도입 (키토산-카테콜)하여 생체친화적이고 빠른 시간 내에 접착성 하이드로젤을 형성하는 방법을 개발하였고, 카테콜이 도입된 히알루론산 (hyaluronic acid)에 카테콜기를 도입 (히알루론산-카테콜)하여 산화그래핀 (graphene oxide)과의 하이드로젤 형성을 통한 약물전달시스템을 개발하였다. 또한 히알루론산-카테콜을 마이크로플루이드 채널 (microfluidic channel) 내부 표면에 고정화하여 혈관내피 환경을 모방한 시스템의 개발과 천연 화학적 라이게이션을 통한 표면개질방법을 개발하였다.
첫 번째로, 표면에 촉매를 고정화시켜 키토산-카테콜 접착성물질의 활성을 유도하여 빠른 시간 내에 하이드로젤이 형성되면서도 최종 결과물에는 촉매가 없는 안전한 하이드로젤 제조시스템을 확립하였다. 이는 라디칼 반응을 매개할 수 있는 헤마틴을 표면에 고정화시킴으로 카테콜의 산화를 통하여 고분자화 (polymerization)되는 것이다. 이에 헤마틴을 주사기 내부에 고정화 시켜 키토산-카테콜 용액을 물리적으로 1분간 섞어 주고 주입하였을 때, 초기 용액은 고점도의 특성이 보이나 30분 이내에 하이드로젤이 형성되는 것을 확인하였다. 이때, 표면에 고정화된 헤마틴은 카테콜기의 활성을 만드는 역할만 하며, 가교 후에는 촉매가 존재하지 않게 된다. 이는 예상하지 못한 독성이 있을 수 있는 생체촉매가 포함된 기존의 연구에서 탈피하여 촉매에 의하여 하이드로젤이 형성되지만 최종 결과물에는 촉매가 없으므로 다양한 의료소재 개발에 있어 응용가능성이 무궁무진하다.
두 번째로, 히알루론산-카테콜과 그래핀-폴리에틸렌글리콜(polyethylene glycol, PEG)-아민을 가교결합하여 하이드로젤을 형성하는 동시에 약물을 로딩할 수 있는 전달체를 개발하였다. 산화 그래핀 특유의 물리적, 전기적, 그리고 열적 성질로 인해 이를 활용한 연구는 복합소제, 반도체 분야부터 생체의학 분야에 이르기까지 계속 확장되고 있다. 히알루론산-카테콜과 그래핀-폴리에틸렌글리콜-아민 사이에 가교결합을 이룸으로써 3.2kPa의 기계적 강도를 갖는 하이드로젤을 형성하였다. 하이드로젤에 항암제인 독소루비신을 수동확산으로 로딩 후, 하이드로젤 내부 그래핀의 존재여부에 따른 약물로딩효율을 비교하였더니 2배의 로딩효율을 나타내었다. 또한 하이드로젤에 로딩된 약물의 지속적인 방출 (sustained-release)여부를 확인하기 위해 방출시간 및 약물활성도를 확인한 결과, 10일후에도 로딩된 약물이 계속 방출되고 약물활성도 역시 갖는 것으로 나타났다. 본 히알루론산-카테콜에 산화그래핀을 도입한 하이브리드 하이드로젤은 약물로딩 효율을 증가시킬 수 있으므로 산화그래핀의 특성을 활용한 생체공학, 조직공학의 연구 응용이 가능하다.
세 번째로는, 혈관내피 환경을 모방하기 위해 히알루론산-카테콜을 마이크로플루이드 채널 (microfluidic channel) 내부 표면에 고정화하여 혈관세포를 배양할 수 있고, 전단응력 (shear stress)에 저항할 수 있는 표면을 제조하였다. 세포 환경을 모방한 마이크로플루이드 채널의 표면개질을 위해 세포외기질 (macromolecular extracellular matrices, ECMs) 분자를 고정화하는 방법을 주로 사용하였으나, 이는 유체 환경에서 분자와 세포 모두 분리되는 문제를 갖고 있다. 유체 환경에서의 접착력 향상을 위해 수중환경에서 강한 접착력을 갖는 홍합의 접착 작용기인 카테콜을 세포외기질 분자인 히알루론산과 접목시켜서 플루이드 채널에 고정화함으로써 기존의 한계를 극복하였다. 또한, 플루이드 채널 내부에 고정화된 히알루론산-카테콜 위에 혈관세포를 배양하고 전단응력을 가하여 150 dyne/cm2까지 버틸 수 있는 표면을 제조하였다. 이는 기존에 보고된 카테콜이 도입된 고분자의 정적 조건 (static condition) 표면 고정화와는 달리 동적 조건 (dynamic condition)에서 수행되었으므로 생체적합성 고분자를 활용한 인공혈관연구에 응용이 가능하다.
마지막으로, 단백질 합성에서 주로 사용되는 천연 화학적 라이게이션 반응을 표면에 도입하여 생체고분자를 표면에 고정화시키는 방법을 개발하였다. 천연 화학적 라이게이션은 티오이스터 (thioester)와 시스테인 (cysteine)사이의 분자 내 친핵성 전위 (intramolecular nucleophilic rearrangement)로 아마이드 결합을 형성하는 화학선택적 (chemoselective chemistry) 반응이다. 이를 이용하여 표면에 폴리에틸렌글리콜을 고정화하여 표면에 비특이적으로 부착되는 단백질을 막고자 하였다. 의료기기에서 주로 사용되는 티타늄 표면에 티오이스터를 갖는 단분자를 화학반응으로 고정화 시킨 후, 시스테인-폴리에틸렌글리콜 용액에 담갔더니 티타늄 표면 90%이상이 오염방지 성질 (antifouling)을 나타내었다.
결론적으로 본 연구에서 개발한 키토산-카테콜, 히알루론산-카테콜 기반의 하이드로젤은 생체친화성, 생분해성이면서도 수분의 존재 하에서 빠르게 접착할 수 있고, 기계적 물성을 유지하기 때문에 수술용 조직접착제, 약물전달용 담체 등 생체의학 분야에 활용될 수 있다. 또한, 플루이드 채널 내부에 히알루론산-카테콜을 고정화 방법은 인공혈관, 스텐트 등 혈관조직공학 분야에 응용될 수 있으며, 천연 화학적 라이게이션 반응을 이용한 폴리에틸렌글리콜의 표면 고정화는 다양한 천연 고분자의 표면 고정화로 확장 할 수 있다.
