Early diagnosis of biological agents is of paramount importance to prevent widespread damages such as economic loss, the casualties and fatal disease in human during bioterrorism or biological warfare. A biobarcode assay would be an ideal platform for rapid, sensitive, and multiplex analysis of biological agents, and its combination with lab-on-a-chip technology can provide a next-generation portable analytical tool. In this study, an integrated lab-on-a-chip that incorporates a biobarcode assay and microcapillary electrophore-sis (μCE) was developed to simultaneously detect multiplex biological agents: three bacteria (Bacillus an-thracis, Francisella tularensis, Yersinia pestis), one virus (Vaccinia virus), and one toxin (Botulinum toxin A).
In the first part, an efficient and sensitive multiplex biological agent detection method based on the DNA biobarcode assay and the μCE technology was performed prior to the development of a biobarcode assay incorporated microdevice. Monoplex as well as multiplex biological agent identification was performed. Through the DNA biobarcode assay process, the magnetic microparticle-pathogen-polystyrene mi-croparticle complexes were formed, and the FAM labeled single stranded barcode DNA could be released from the complexes upon denaturation. Different length of a barcode DNA was designed to designate each biological agent, so that the specific peak elution time in the capillary electrophoresis on a chip allows distinguishing the target with high accuracy within 3 min. To exactly confirm the barcode DNAs in the electropherogram, each of which was correspondent to the specific biological agent, two bracket ladder probes that allows identifying the barcode DNAs with high assignment accuracy were added. Owing to the abundant amount of barcode DNAs, the presence of Bacillus anthracis, Francisella tularensis, Yersinia pestis, Vaccinia virus was confirmed with a limit of detection of 50 CFU/mL, while Botulinum toxin A was analyzed even at a concentration of 12.5 ag/mL. Multiple biological agent detection was also successfully conducted in a phosphate buffered saline as well as a serum medium with background of other biological agents. Thus, this analytical platform based on the biobarcode assay and on-chip CE analysis provides rapid, sensitive, multiplex, and accurate biological agent identification.
In the second part, based on the off-chip experiment in the first part, a biological agent detection system through an integrated lab-on-a-chip was developed. The microdevice consists of the micropump for injecting the samples and particle probes, a passive mixer for inducing the conjugation between the particle probes and the biological agents, a magnetic separation chamber to purify the particle probe-biological agent complexes, and a μCE channel to separate and identify the barcode DNAs. Monoplex biological agents were analyzed with a limit of detection of 102 CFU/mL and the duplex, triplex, and quintuplex combination of biological agents were also confirmed with 103 CFU/mL concentration. Furthermore, F. tularensis in a serum medium or in presence of other pathogens could be successfully analyzed. The total analysis time from injection to detection was complete in 30 min, demonstrating this methodology can be applicable for rapid on-site real sample analysis.
오늘날 생화학테러로 인한 사상자의 발생 및 경제적 손실 등의 피해가 크게 퍼지는 것을 막기 위해, 고위험병원체의 조기 진단이 매우 중요한 주제로 떠오르고 있다. 바이오바코드 어세이는 고위험병원체의 고속, 고감도 및 다중 검출에 적합하며, 이를 랩온어칩 기술과 접목시킬 경우 차세대 휴대용 진단 기기로써 쓰일 가능성이 있다. 본 연구에서는, 다섯 가지의 고위험병원체(Bacillus anthracis, Francisella tularensis, Yersinia pestis, Vaccinia virus, Botulinum toxin A)를 동시에 검출하기 위해 바이오바코드 어세이가 결합된 통합형 마이크로디바이스를 개발하였다.
바이오바코드 어세이 통합형 마이크로디바이스의 개발에 앞서, 바이오바코드 어세이 및 모세관 전기영동 기술을 이용한 고효율, 고감도 및 다중 고위험병원체 검출 플랫폼을 개발하였다. 이를 통해 단일 병원체 검출뿐만 아니라 다중 병원체 검출 또한 확인할 수 있었다. 우선 바이오바코드 어세이를 통하여 자성 마이크로입자-병원체-폴리스티렌 마이크로입자 복합체가 형성되었으며, FAM이 결합된 단일 가닥 바코드 DNA가 복합체로부터 해리 되었다. 길이가 다른 각각의 바코드 DNA는 특정 고위험병원체를 의미했으며, 칩 위에서의 모세관 전기영동을 통해 얻은 피크의 용리 시간에 따라, 높은 정확성으로 타겟을 구별해 낼 수 있었다. 또한 두 개의 래더 프로브를 항상 같이 넣어줌으로써, 타겟 바코드 DNA의 정확한 위치를 정할 수 있었다. 이 시스템을 통하여 Bacillus anthracis, Francisella tularensis, Yersinia pestis, Vaccinia virus 단일 병원체를 50 CFU/mL의 농도까지 검출할 수 있었으며, Botulinum toxin A는 12.5 ag/mL까지 검출할 수 있었다. Phosphate buffered saline뿐만 아니라 여러 병원체와 함께 혈청에 섞인 타겟 고위험병원체의 다중 검출 또한 성공적으로 확인하였다. 결론적으로, 바이오바코드 어세이 및 온칩 모세관 전기영동에 기반한 본 분석 플랫폼은 고속, 고감도, 다중 및 정확성 높은 고위험병원체 검출을 가능케 하였다.
검출 플랫폼 확립 후, 통합형 고위험병원체 검출 마이크로디바이스를 개발하였다. 마이크로디바이스는, 샘플 및 프로브입자를 디바이스에 주입시킬 마이크로펌프, 프로브입자 및 고위험병원체 사이의 결합을 유도해 자성 마이크로입자-병원체-폴리스티렌 마이크로입자 복합체 형성을 돕는 수동혼합기, 복합체를 정제할 자성 분리 챔버, 및 바코드 DNA를 분리하고 확인할 모세관 전기영동 채널로 이루어져있다. 단일 병원체는 102 CFU/mL의 농도까지 분석 가능했으며, 103 CFU/mL 농도로 섞인 다중 병원체들 또한 분석 가능하였다. 이에 더불어, 혈청 혹은 다른 여러 병원체들과 섞인 F. tularensis의 존재 또한 명확히 검출해 낼 수 있었다. 샘플 주입부터 검출까지의 모든 과정을 30분 이내로 확립하였으며, 이러한 마이크로디바이스는 고속 샘플 현장 진단 등의 분야에서 응용될 수 있을 것이다.
