A few form of the cytoplasmic polyol dehydrogenase having a distinct cofactor and substrate specificity was isolated from the cell free extracts of the sorbitol grown cells of $\mbox{\underline{G.}}$ $\mbox{\underline{melanogenus}}$ and purified partially by a CM-cellulose and a Sephadex G-100 column.
The enzyme was found to be a dye-coupled oxidoreductase unlike all the other known cytoplasmic polyol dehydrogenases, and its catalytic activity was demonstrated only in the presence of an artificial electron acceptor like DPIP. The enzyme did not show any requirement of nicotinamide nucleotide coenzymes, $NAD^{+}$ or $NADP^{+}$, or molecular oxygen for the enzymatic polyol oxidation. The enzyme showed a very restricted substrate specificity toward the polyols having D-lyxo configuration such as D-mannitol and D-sorbitol. Stoichiometric composition of the polyol and DPIP for this enzyme catalyzed reaction showed a linear quantitative relationship between the ketose formation and the DPIP reduction.
The steady-state kinetic studies on the dye-coupled polyol-dehydrogenase was carried out by the initial velocity measurements in the polyol oxidation and by the product inhibition analysis. The product inhibition patterns obtained by D-fructose (one no-inhibition, one noncompetitive, and two competitive) as well as the initial rate experiments showing the typical parallel pattern in the double reciprocal plot may provide the confirmatory evidences that the polyol oxidation by the enzyme proceeds by a ping-pong bi-bi mechanism. Based on the kinetic parameters obtained, it was also suggested that a rate-limiting step of the enzymatic polyol oxidation is associated with release of the ketose from the enzyme-polyol complex.
The involvement of some essential side chain groups for the enzyme catalysis was suggested based on the results of the experiment on the pH dependency of the kinetic parameters, Kma and Vmax, of the enzyme reaction and the chemical modifications including the photooxidation in the presence of methylene blue, the ethoxyformylation by sodium diethylpyrocarbonate, and the treatment of various sulfhydryl reagents. An imidazole group of a histidine, a carboxyl and sulfhydryl(s) are regarded as the functional groups for the enzyme catalysis. The differences in the properties of the enzymes and their reaction mechanism between the new type polyol dehydrogenase and all the other polyol dehydrogenases were discussed and a probable catalysis mechanism for the enzyme catalysis was proposed based on the obtained results.
초산 박테리아 속의 하나인 G. melanogenus 로 부터 새로운 포리올 탈수소 효소를 얻어 정제 하였으며, 이 효소의 특성을 연구 검토 해본 결과 이 효소는 지금까지 알려진 바의 포리올 탈수소 효소와는 달리 조효소로써 $NAD^{+}$나 $NADP^{+}$ 등을 필요로 하지 않는 대신 2,6-dichlorophenolindophenol (DPIP) 와 같은 인위적인 전자 수용체와 직접 연결되어 있음을 알았다. 한편 효소의 기질 특이성에 있어서도 D-Mannitol 이나 D-sorbitol 과 같은 D-lyxo 구조를 갖는 포리올에 대하여서만 특이하게 작용하여 각각의 포리올 들에 해당하는 캐토스인 D-Fructose 와 D-Sorbose 를 생성 시킴을 알았다. 또한 이 효소는 세포질에서 분리된 어떠한 포리올 탈수소효소와도 달리 산성에서 최적 활성도를 나타내었다. 이 효소의 분자량은 약 100,000 정도 였으며 세포질에 존재함을 알 수 있었는데 이점은 이 효소에 의해 촉매되는 포리올 산화 반응에 있어 산소분자가 전자 수용체로 쓰이지 않는다는 점과 아울러 세포막에서 발견된 포리올 산화 효소와도 구분 될수 있었다.
이제까지 보고된 포리올 탈수소 효소와는 다른 특이한 이 효소의 반응 기전을 반응 속도론적 연구를 통하여 규명 하고자 시도 하였으며, 포리올 산화 반응에 대한 초기속도 측정 실험과 효소 반응 산물인 케토스에 의한 저해 실험을 통하여 이 반응은 ping-pong bi-bi 형의 반응 기전으로 진행됨을 확인하였다. 따라서 두 기질 즉 포리올 로서 D-Mannitol 및 전자수용체로서 DPIP 가 이 효소에 의하여 반응이 진행될 경우 D-Mannitol이 우선 효소와 작용하며 첫 반응 산물로서 해당되는 케토스인 D-Fructose 가 생성됨을 추측 하였다. 인위적 전자 수용체로서 DPIP 와 또 다른 전자 수용체인 Ferricyanide 를 반응 시켰을 때의 효소 촉매 반응 속도의 실험 결과를 비교함으로써 포리올이 캐토스로 산화되는 이 과정이 전체 효소 반응 속도를 조절하는 반응임을 추정할수 있었다.
이 효소의 최대 활성도와 기질 친화성에 미치는 수소 이온 농도의 영향에 대한 실험 및 비교적 선택적으로 단백질의 커ㅌ사슬에 화학 변화를 일으키는 저해제의 이 효소 활성에 주는 영향에 관한 실험 결과들로 부터 imidazol 기, carboxyl 기 및 thiol 기 등이 이 효소의 촉매작용에 필수적인 것으로 추정 되었으며 이 촉매 반응에 관여하는 이들 관능기들의 작용 형식을 추측하였다. 이상의 얻어진 결과들로 부터 이 효소에 의하여 촉매되는 포리올로 부터 케토당으로의 산화반응에 대한 하나의 가능한 모델을 제안 하였다.
