This basic mechanism of fragmentation of liposome was investigated by two related but independent approaches. In the first approach, glucagon was used to fragment dimyristoylphosphatidylcholine (DMPC) liposome. Glucagon was found to interact with DMPC liposome below pH 3.3 At the lipid to protein molar ratio of 100 or above, DMPC liposome forms a vesicular complex with glucagon. At lower lipid/protein ratio, however, the vesicle was fragmented into a discoidal complex. The ordered secondary structure of glucagon, which was of a random coil between pH 2 and 12, was induced in lipid-protein complex. Both N-terminal and C-terminal of glucagon participated in the formation of discoidal complex with DMPC. Tryptophan of glucagon was located close to the interface between bilayer and water in vesicular complex. But when it is in discoidal complex, it was located near the middle of the lipid bilayer. An amphiphilic secondary structure, which contains tryptophan of glucagon, may protect the exposed acyl chain of fragmented DMPC liposome.
In the second approach, it was found that DMPC liposome was fragmented spontaneously upon a prolonged incubation at low pH. The turbidity of DMPC liposome suspension decreased slowly with time when incubated at low pH without any added protein or detergent. Electron microscopic observation revealed the formation of stacked-up discoids. NMR studies indicated that all the choline groups are accessible to the added chemical shift agent, corroborating the fragmentation of the vesicles into a discoidal form. DMPC was subsequently found to be hydrolyzed into lysophosphatidylcholine (lysoPC) and myristic acid under the same condition as the fragmentation. That the discoidal fragment consisted of DMPC and its hydrolysis products of lysoPC and myristic acid was verified from the discoids, which was formed by reconstitution as revealed by electron microscopy. The reconstitution was done by mixing these components at neutral pH. 50% of cholesterol content prevented DMPC vesicles from fragmentation. A model for this discoidal complex, where a patch of DMPC bilayer is surrounded by lysoPC at its periphery, is proposed.
Phosphatidylcholine 으로 만들어진 리포좀이 단편화 되는 현상을 두 가지의 독립된 방법으로 연구하였다. 리포좀이 단편화되려면 리포좀의 구성물질인 인지질의 특성상, 노출되는 지방산 사슬을 물로부터 막아줄 수 있는 양쪽성 성질을 갖는 단백질이나 세탁제가 첨가되어야 한다.
첫 번째 방법은 펩티드 호르몬인 글루카곤을 이용하였다. 글루카곤은 산성도 3.3. 이하에서 dimyristoyl phosphatidylcholine(DMPC) 으로 만들어진 리포좀에 결합되며 인지질/글루카곤의 몰비가 100 이하로 되면 리포좀을 깨뜨리는 것이 관찰되었다. 용액 상태로 존재할 때는 특정한 구조를 갖지 않았던 글루카곤은 인지질과 결합되면서 이차 구조가 생겼으며 양쪽성 성질을 갖는 이 이차구조로 안정된 글루카곤-DMPC 결합체를 이루고 있으며 글루카곤의 대부분의 아미노산이 결합에 참가하고 있었다. 글루카곤과 인지질막이 결합될 때 주로 작용하는 힘은 정전기적 인력 보다는 소수성 힘이 었으며 용액의 산성도에 따라 글루카곤의 구조에는 별 차이가 없으므로 산성도에 따라 글루카곤이나 인지질막의 소수성도가 변하여 그들 간의 반응도가 달라 지는것 같으며 양쪽성 성질을 갖는 이차 구조thⓟ 결합의 전제 조건이 아니며 두 물질의 결합체를 안정화 시키는 데 필요한 것 같다. 인지질/글루카곤의 값이 100 이상일 때의 결합체는 리포좀의 본래 모양을 그대로 유지하는 형태이며 이때 글루카곤의 위치는 doxyl기를 이용한 실험 결과에 의하면 인지질막과 물과의 경계면과 가까운 부분이었다. 따라서 이러한 결합체를 이룰 때 글루카곤은 인지질막을 이루는 인지질의 지방산 사슬에 수직에 가까운 모양으로 놓여지게 되리라 생각된다. 인지질/글루카곤의 값이 100 이하일 때는 리포좀이 깨어져 원반 같은 조각으로 되며 이때 글루카곤의 트립토판의 위치는 인지질막의 가운데 부분에 위치한다. 따라서 노출되는 인지질의 지방산 부분은 인지질과 결합하여 유도되는 글루카곤의 양쪽성 성질의 이차 구조를 이루는 두 부분(5-10, 19-25)에 의해 물로 부터 보호되며 이 때 글루카곤은 지방산 사슬과 평행하게 놓일 것으로 보인다.
두번째 방법으로는 낮은 산성도로 리포좀을 단편화시켰다. DMPC 리포좀을 산성 용액에 장시간 두면 외부에서 다른 물질을 첨가해 주지 않아도 저절로 깨어져서 현탁도가 줄어드는 현상이 관찰되었다. 전자 현미경 관찰 결과와 핵자기공명법에 의하여 리포좀이 깨어져 원반같은 모양을 하고 있음을 확인하였다. 이와 같은 현상의 원인을 조사한 결과 산 촉매 하에서 일어나는 DMPC 의 가수분해로 인해 생기는 lysophosaphatidylcholine(lysoPC) 의 양이 증가하는 것 때문인 것으로 밝혀졌다. 콜레스테롤을 50% 첨가하여 리포좀을 만들 경우 DMPC 의 가수분해가 일어나도 리포좀의 형태가 그대로 유지되도록 할 수 있었다.
