His 67 residue is highly conserved among subtilisin family and changed to Arg in mammalian subtilisin-like proteins. To elucidate the structural and functional role of His 67 residue in subtilisin E, site-directed mutagenesis was carried out. Three mutants of subtilisin E with Ala 67, Glu 67 and Gly 67 were obtained. Each mutant was characterized in terms of proteolytic activity. Compared with wild type, proteolytic activity for Ala 67 mutant was about 30%. Glu 67 and Gly 67 mutant did not show any detectable proteolytic activity on N- succinyl- L- Ala- L- Ala- L- Pro- L- Phe- p- nitroanilide but developed hallow zones onto the skim-milk plate. It is expected that His 67 residue in subtilisin E influences on catalytic efficiency.
His 67 잔기는 여러 서브틸리신 내에서 높은 보존도를 보이며 아미노산 서열 배열시 포유동물의 서브틸리신유사단백질의 경우에는 Arg 으로 바뀌어져있다. 이에 서브틸리신 E 에서 His 67 잔기의 구조및 기능적 역활을 규명하기 위해서 부위특이돌연변이 방법을 이용해 이 잔기를 각각 Ala 67, Glu 67 그리고 Gly 67 로 치환시켰다. 이들 각 돌연변이 서브틸리신 E 의 특성을 단백질 분해능력의 면에서 관찰하였다. 먼저 야생형(wild-type)에 비해서 Ala 67 돌연변이체는 약 30%의 단백질 분해능력을 보였다. Glu 67 과 Gly 67 돌연변이체에서는 인위적 기질 펩티드에 대해 이를 가수분해하는 능력이거의 보이지 않았다. 그러나 이 두 돌연변이체에는 skim-milk 배지에서 투명한 zone을 형성하였다. 이들 결과에 따라 서브틸리신 E 에서 His 67 잔기는 촉매효율에 영향을 주는 것으로 생각된다. 또한 이 잔기의 기질결합과의 관련성도 배제 할 수는 없다.
