Human granulocyte colony stimulating factor (G-CSF) and human granulocyte macrophage colony stimulating factor (GM-CSF) are the most widely used human hemopoietic factors to remedy
different forms of neutropenia, chemotherapy-induced leucopenia, and in the mobilization of progenitor cells for autologous or allogenic transplantation. These colony stimulating factors maintain the level of blood cells within narrow limits, regulate and coordinate the proliferative activity of hemopoietic tissue, and play an essential role in response to emergent situations; for example, blood loss, or acute infection, and so on. Although these factors have been produced by many production technologies, recombinant human colony stimulating factors expressed using E. coli and CHO cell culture were approved for clinical application. For their production in large amount and cheaper expense, the method using milk of transgenic animal, so called animal bioreactor, was introduced.
For mammary gland-specific expression of human CSFs in transgenic animals, goat β-casein
promoter was used in the construction of expression cassette. Four fragments in various length, 0.6 kb, 1.7 kb, 5.5 kb, and 7.0 kb, were amplified by polymerase chain reaction from a 9.3 kb fragment containing the known goat β-casein promoter and truncated exon 1 and subcloned into pBluescript II SK(+) plasmid. Human G-CSF and GM-CSF gene were subcloned in front of bovine growth hormone (BGH) terminator of pRc/RSV vector, and then the fragments containing CSF genes and BGH terminator were subcloned behind the goat β-casein promoters. These constructs were named as pGbc0.6-hGCSF/GMCSF, pGbc-hGCSF/GMCSF, pGbc5.5-hGCSF, and pGbc7.0-hGCSF according to
the length of goat β-casein promoter and the name of the structural gene. The constructed vectors were introduced into HC11 cell, a mammary gland originated epithelial cell line, by stable transfection to verify expression of human CSFs under direction by goat β-casein promoter. Human G-CSF was present at the level of 3.7 ng/ml in the culture media of HC11 cell stably transfected with pGbc0.6-hGCSF as judged by Quantikine ELISA kit. In the culture media of HC11 cell transfected with pGbc-hGCSF, human G-CSF was secreted up to level of 29.7 ng/ml. In contrast to the above, the level of human GCSF was reduced to 70.4 pg/ml in the HC11 cell culture transfected with pGbc7.0-hGCSF. The levels ofhuman GM-CSF in the HC11 cell culture transfected respectively with pGbc0.6-hGMCSF and pGbchGMCSF were about 40 ng/ml. The biological activity of human GM-CSF was confirmed based on the proliferation of human GM-CSF dependent AML-193 cells after the addition of the culture media. There was no significant difference in the biological activity in the culture media compared to commercially available human GM-CSF.
After the expression of human CSFs was identified in the model animal cell system, the efficacy
of the method “animal bioreactor” was investigated in the model transgenic animal. Expression cassettes of pGbc0.6-hGCSF, pGbc-hGCSF, pGbc5.5-hGCSF, and pGbc7.0-hGCSF were isolated and
microinjected into male pronuclei of mouse fertilized zygotes. After microinjection of pGbc7.0-hGCSF, 808 embroys were transferred to pseudopregant recipient ICR mice and 11 transgenic mice were obtained from 139 offspring. In the case of pGbc5.5-hGCSF, 238 embryos microinjected were transferred and 2 transgenic mice were from 50 littermates. Four hundred eighty three embryos microinjected with pGbc-hGCSF were transferred and 4 transgenic mice were obtained from 82 progeny. The expression cassette of pGbc0.6-hGCSF was microinjected and 376 embryos were transferred. Eight transgenic mice were identified from 53 offspring. The levels of human G-CSF expressed in the transgenic mice milk were varied from 0 up to 10 ug/ml. As the promoter length in the transgene was elongated, the copy number of transgene showed a tendency to be increased. Moreover, there was a but not strong relationship between the copy number of transgenes and expression level of human G-CSF in the milk of transgenic mouse. It could be concluded that the length of goat β-casein promoter gives a substantial influence on the integration of foreign expression cassette and its expression. The secreted human G-CSF exhibited unsaturated O-glycosylation. The level of O-glycosylation was significantly lower than commercially available O-glycosylated human G-CSF.
Two transgenic goats, one male and the other female, harboring the expression cassette of pGbchGCSF
were developed by microinjection into fertilized one-cell goat zygotes. During the breeding season in Korea, a goat embryo recovery and transfer program using a Korean native strain (Capra hircus aegagrus) was performed for the production of transgenic goats. Donors were synchronized with norgestomet implants and superovulated by a combined treatment with FSH and hCG. A 50.5% of the recovered embryos were fertilized and most of them were 1-cell stage. After microinjection of the expression cassette of pGbc-hGCSF, a total of 188 embryos were immediately transferred to naturally cycling or hormonally synchronized recipients with 2 or 3 embryos per animal. Altogether, 188 embryos were transferred to 71 recipients and produced 2 transgenic Korean goats from 25 offspring. Human GCSF was produced at levels of up to 50 ug/ml in the transgenic goat milk. Its biological activity was equivalent to recombinant human G-CSF expressed from Chinese hamster ovary (CHO) cell when assayed using in vitro HL-60 cell proliferation. Human G-CSF from transgenic goat milk increased the total number of white blood cells in C57BL/6N mice with leucopenia induced by cyclophosphamide (CPA). The secreted human G-CSF was glycosylated although the degree of O-glycosylation was lower compared to CHO cell-derived human G-CSF. The degree of O-glycosylation of human G-CSF produced in the transgenic goat milk was lower than that of human G-CSF secreted in the transgenic
mouse milk.
사람 과립구 콜로니 자극인자와 사람 과립구 대식세포 콜로니 자극인자는 여러가지 호중구 감소증, 화학요법에 의해 유도되는 백혈구 감소증의 치료 및 이식수술을 위한 분화된 조혈세포들의 mobilization 에 가장 많이 이용되고 있는 사람 조혈 성장인자이다. 이들 콜로니 자극 인자들은 혈구 세포들의 수를 좁은 범위내에서 유지되도록 하며 조혈조직의 생장활성을 조절하며 동시에 긴급한 상황에서 중요한 역할을 수행한다. 이들 인자들은 지금까지 여러가지 방법에 의하여 생산되어왔지만 지금까지 대장균과 CHO 세포에서 생산된 재조합 콜로니 자극인자들만이 임상적 이용을 승인받은 상태이다. 이들 조혈인자들을 대량으로 저렴하게 생산하기 위하여 형질전환 동물의 유즙을 이용하는 동물 생체 배양기라고 불리우는 방법을 도입하였다.
형질 전환 동물에서 사람 콜로니 자극인자들을 유선 조직 특이적으로 발현하기 위하여 흑염소의 베타카제인 프로모터를 이용하여 발현체를 구성하였다. 다양한 길이(0.6, 1.7, 5.5, 그리고 7.0 kb)를 갖는 프로모터 조각들을 중합효소연쇄반응을 이용하여 클로닝된 9.3kb 의 프로모터 및 인접부위로부터 증폭한 후 이를 pBluescript II SK 플라스미드에 옮겼다. 사람 과립구 또는 과립구 대식세포 콜로니 자극인자 유전자들을 pRc/RSV 벡터의 소 성장호르몬 전사종결부위 앞에 삽입한 다음 사람 콜로니 자극인자 유전자와 소 성장호르몬 전사종결부위를 분리하여 앞에서 기술한 흑염소 베타카제인 프로모터 뒤에 연결하였다. 이렇게 만들어진 발현벡터들을 흑염소 베타카제인 프로모터의 길이와 삽입된 콜로니 자극인자 이름에 따라 pGbc0.6-hGCSF/hGMCSF, pGbc-hGCSF/hGMCSF, pGbc5.5-hGCSF 그리고 pGbc7.0-hGCSF 라고 명명하였다. 이들 발현벡터들은 흑염소 베타카제인 프로모터에 의한 사람 콜로니 자극인자의 생산이 이루어지는지를 검정하기 위하여 생쥐의 유선조직 상피세포로부터 유래한 HC11 세포주에 stable transfection 방법에 의하여 도입되었다. 발현벡터 pGbc0.6-hGCSF 가 도입된 HC11 세포주에서는 3.7 ng/ml 의 수준으로 사람 과립구 콜로니 자극인자가 생산되는 것을 ELISA 방법으로 확인할 수 있었으며, pGbc7.0-hGCSF 가 도입된 세포주에서는 29.7 ng/ml 의 사람 과립구 콜로니 자극인자가 배지로 분비되는 것을 알 수 있었다. 이에비하여 pGbc7.0-hGCSF 가 도입된 세포주에서는 발현이 현저히 낮은 수준 (70.4pg/ml) 으로 감소되는 것을 알 수 있었다. 사람 과립구 대식세포 콜로니 자극인자의 발현은 pGbc0.6-hGMCSF 나 pGbc-hGMCSF 벡터가 도입된 HC11 세포주에서 모두 40 ng/ml 의 수준으로 이루어졌으며, 활성을 사람 과립구 대식세포 콜로니 자극인자에 성장 의존성을 보이는 사람 급성 단구성 백혈병 유래 세포주의 증식을 통해 검정하여 보았을 때, 상업적으로 이용되고 있는 사람 과립구 대식세포 콜로니 자극인자와 차이를 보이지 않았다.
모델 동물세포 시스템에서 발현을 확인한 후, 동물 생체 배양기라고 불리우는 방법의 유효성을 형질전환 모델동물에서 조사하였다. 각각의 발현벡터들로부터 발현체를 분리한 다음, 이들을 생쥐 수정란의 웅성전핵에 미세주입하였다. pGbc7.0-hGCSF 를 주입한 경우, 808 개의 배아들을 대리모에 이식하여 139 수의 산자들을 얻었고 이로부터 11 마리의 형질 전환 생쥐가 얻어졌다. pGbc5.5-hGCSF 의 경우, 238 개의 배아가 미세주입된 후 이식되어서 50 마리의 산자가 태어났고, 이들중 2 마리의 형질전환 생쥐를 얻었다. pGbc-hGCSF 를 483개의 배아에 미세주입하여 총 82 마리의 산자들을 얻었고 4 마리의 형질전환 생쥐가 확인되었다. pGbc0.6-hGCSF 의 발현체를 주입하였을 때에는 총 376 마리의 배아로부터 53 마리의 산자들을 얻었고 이들 중 8 마리의 형질전환 생쥐를 얻었다. 이들 형질전환 생쥐들의 유즙에서 사람 과립구 콜로니 자극인자는 0 ? 10 ug/ml 의 수준으로 발현됨을 확인할 수 있었다. 사용된 프로모터의 길이가 길어짐에따라 생쥐의 염색체내로 삽입된 발현체의 수가 증가하는 경향성을 보여주었다. 더나아가서 강하지는 않지만 이들 프로모터의 길이와 발현 수준과도 상관관계가 있음을 알 수 있었다. 이를 통해, 외부로부터 도입된 발현체의 삽입과 그 발현에 흑염소 베타카제인 프로모터의 길이가 영향을 주고 있음을 알 수 있었다. 발현된 사람 과립구 콜로니 자극인자는 포화되지 못한 O 당쇄화를 보였다.
발현벡터, pGbc-hGCSF 의 발현체를 갖는 두마리의 형질전환 흑염소가 1 세포기 수정란 미세주입법에 의하여 얻어졌다. 한국에서의 교미기간동안 한국산 재래종 흑염소를 이용한 수정란 회수 및 이식이 이루어졌다. Norgestomet 이식으로 공여체를 동기화한 다음 난포자극 호르몬과 사람 융모성 성선자극 호르몬을 처리하여 과배란을 유도하였다. 회수된 배아의 50.5%가 정상적인 수정란이었고 대부분의 1 세포기였다. pGbc-hGCSF 의 발현체가 미세주입된 총 188 개의 수정란을 자연발정이 온 대리모나 호르몬처리에 의하여 동기화된 대리모에 한 마리당 2-3 개씩 이식하였다. 총 71 마리의 이식된 대리모로부터 총 25 마리의 산자를 얻었고 이들 중 2 마리가 형질전환되었음을 확인할 수 있었다. 형질전환 흑염소의 유즙에서 사람 과립구 콜로니 자극인자는 약 50 ug/ml 의 수준으로 발현되고 있었다. 생물학적 활성을 사람 전골수구성 백혈병 세포주인 HL-60 를 이용하여 생체외에서 조사하였을때, 당쇄화가 되어있는 CHO 세포주로부터 생산된 사람 과립구 콜로니 자극인자와 동일하였다. 또한 형질전환 흑염소 유즙으로 분비된 사람 과립구 콜로니 자극인자는 CPA 라는 약품에 의해 백혈구 감소증을 보이는 C57BL/6N 생쥐의 백혈구 숫자를 증가시키는 활성을 보였다. 이러한 사람 과립구 콜로니 자극인자는 비록 CHO 세포주로부터 생산된 것에 비하여 당쇄화정도가 낮았지만 당쇄화가 되어있음을 알 수 있었다. 그 당쇄화의 정도는 형질전환 생쥐에서 생산된 사람 과립구 콜로니 자극인자에 비하여 낮은 수준이었다.
