DPPC-Cholesterol mixture is one of widely studied model systems for ordered domains in cell mem-brane. It is known to exist in gel phase at low mole fraction of cholesterol and liquid ordered phase at high mole fraction of cholesterol under chain melting temperature of DPPC. Especially, gel to liquid ordered phase transition is considered as an important factor for lipid raft formation. However, low cholesterol fraction re-gion has been poorly studied due to its extremely slow dynamic property. Despite this difficulty, the study of dynamic process for DPPC + low mole fraction of cholesterol mixture would be needed to understand funda-mentals of cell membrane mechanics.
Here, we report the diffusion process of DPPC-Cholesterol multilayer as a function of cholesterol mole fraction using fluorescence correlation spectroscopy (FCS). We found that there are two distinct diffusion modes at different cholesterol fraction region. First, fast anomalous diffusion was observed at low cholesterol fraction region (0~5% of cholesterol concentration). Mean square displacement (MSD) analysis also supports that anomalous diffusion is dominant at this region. Specifically, diffusion coefficient tends to increase two times as multilayer contains more cholesterol from 0 to 5%. However, over 7% of cholesterol fraction, slow Brownian diffusion was observed , and this is consistent with previous researches.
We propose that boundary lines between DPPC subdomains are the origin of fast anomalous diffusion process at low cholesterol fraction region. Recently, people report that gel phase contains several subdomains induced by chain tilt. Because boundary lines contain disordered structure, Lissamine Rhodamine B-DPPE dyes would be partitioned into boundary line, rather than ordered DPPC subdomains. The fast diffusion may come from the disordered structure of boundary line, and anomalous character is caused by confined movement inside boundary line. In addition, we also correlate the increased diffusion coefficient with the extended boundary lines by adding more cholesterol up to 5%. On the other hand, chain tilt-to-untilt transition occurs at high cholesterol fraction region, and this disrupts the subdomains. Thus, fluorescence dyes would be uniformly distributed within DPPC molecules, and this may lead the change in diffusion process from fast anomalous diffusion to slow Brownian diffusion. X-ray reflectivity study also confirms that DPPC-Cholesterol multilayer undergoes chain tilt-to-untilt transition up to 7% by observing better vertical order and increased lamellar spacing.
In conclusion, we investigate the structure induced anomalous diffusion at low cholesterol fraction re-gion. Because anomalous diffusion is frequently observed phenomena in cell membrane by proteins and cytoskeleton, our study can be a useful approach for membrane dynamics research.
Diplamitoylphosphatidylcholine (DPPC)-콜레스테롤 mixture는 세포막에 존재하는 ordered do-main들을 연구하기 위해 널리 쓰이는 model system 중 하나이다. 이것은 DPPC의 chain melting 온도 이하에서 낮은 콜레스테롤 비율을 가질 때는 젤 상태, 높은 콜레스테롤 비율을 가질 때는 정렬된 액상으로 존재한다. 특히, 젤 상태에서 정렬된 액상으로의 상 변이는 지질 뗏목의 생성에 있어 중요한 요소로 여겨지고 있다. 그럼에도 불구하고, 낮은 콜레스테롤 비율을 가지는 영역은 매우 느린 동적 성질 때문에 비교적 연구가 덜 되어왔다. 그러나, 이 부분에 대한 연구는 세포막의 기계적 성질을 상세하게 밝혀내는 데 있어서 매우 중요하다
이를 위해 우리는 콜레스테롤 양에 따라 DPPC-콜레스테롤 다중막의 확산 변화를 형광 상관 분광학을 이용하여 관찰하였다. 우리는 서로 다른 콜레스테롤 비율 영역에서 일어나는 서로 다른 확산 과정이 발견하였다. 먼저 0~5%의 낮은 콜레스테롤 비율을 가지는 영역에서는 빠르고 변칙적인 확산이 일어났다. 우리는 이 영역에 대한 평균제곱거리 분석을 통해 변칙적 확산이 일어난다는 것을 재확인 하였다. 이 영역에서 확산 상수는 콜레스테롤 함유량이 많을수록 두 배 가량 커지는 경향을 보였다. 반면에, 7~50%의 높은 콜레스테롤 비율을 가지는 영역에서는 느린 Brownian 확산이 일어났으며, 확산 계수 값은 앞서 연구된 값들과 일치하는 양상을 보였다.
우리는 DPPC subdomain 사이에 생기는 경계선을 이와 같은 확산 현상의 원인이라고 제시했다. 최근, DPPC 젤 상은 chain 기울어짐과 관련 있는 여러 subdomain들로 나누어진다는 것이 보고되었다. 이 subdomain들 사이의 경계선은 잘 배열되어있지 않은 구조를 가지고 있기 때문에 FCS 실험에서 우리가 사용하는 Lissamine Rhodamine B-DPPE 가 이 경계선 사이에 끼어 들어갈 것으로 예상된다. 따라서 빠른 확산은 경계선의 배열되어있지 않은 구조 때문에 일어나며, 변칙성은 염료의 움직임이 경계선의 모양에 따라 제한을 받아서 생기는 것으로 이해할 수 있다. 또한, 확산 계수 값의 증가는 이 경계선을 늘리는 콜레스테롤의 역할을 통해 설명할 수 있다. 낮은 콜레스테롤 비율 영역과 높은 콜레스테롤 비율 영역 에서의 확산 과정 차이는 chain의 기울어진 상태에서 기울지 않은 상태로의 변화 때문인 것으로 생각된다. Chain의 기울어짐은 DPPC subdomain의 형성에 기초적인 부분을 담당하고 있다. 따라서, chain의 기울어진 상태에서 기울지 않은 상태로의 변화는 subdomain 구조를 해체하여 염료 분자들이 DPPC 분자들 사이에 균등하게 분포하도록 유도한다. 이 상황에서는 빠른 변칙적 확산보다는 느린 Brownian 확산이 일어나게 된다. X선 반사 실험은 이러한 DPPC-콜레스테롤 다중막이 chain의 기울어진 상태에서 기울지 않은 상태로의 상 변이를 일으킨다는 우리의 주장을 재확인 해준다. 수직방향 정렬과 층간 간격 분석에서 이들은 콜레스테롤 비율이 낮은 영역에서 높은 영역으로 가면서 증가했으며, 이는 chian 이 기울어진 상태에서 기울지 않은 상태로 상 변이를 한다는 것을 의미한다.
결론적으로, 우리는 낮은 콜레스테롤 함량 영역에서 DPPC-콜레스테롤 다중막의 구조를 빠른 변칙적 확산 관찰을 통해 설명하였다. 실제로 세포 내에서 변칙적 확산은 단백질이나 세포 골격에 의해 자주 유도되는 현상이므로, 우리의 연구가 앞으로의 세포막 연구에 좋은 접근 방법을 제시했다고 할 수 있다.
