In this study, a method that produces PE liposomes with controlled size was developed by adopting microfluidic hydrodynamic flow focusing device. Average diameter of produced PE liposome was controlled by adjusting the flow rate ratio (FRR). Produced PE liposomes were used as vaccine adjuvants to amplify the vaccine efficacy for porcine circovirus type 2 (PCV2), which caused postweaning multisystemic wasting syndrome (PMWS) in pigs. Experimental data were used to construct a mathematical model to explain immune responses to PCV2 infection and vaccination.
Firstly, process for the production of PE liposomes with controlled size was developed by adopting microfluidic hydrodynamic flow focusing device. Microfluidic device was fabricated using conventional photolithography and soft lithography based on polydimethylsiloxane (PDMS) molding technique. Soft lithography was adopted for simple and cost-effective fabrication of devices. In order to achieve flow stability in device, various designs were investigated, and 30°-angled or curved intersecting devices satisfied the flow stability with FRR up to 50. Mixtures of 1,2-dimyristoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine (DMPE), dihexadecyl phosphate (DCP), and cholesterol (Chol) were used to produce liposome. Effect of each component on the quality of produced liposome was investigated by bulk experiment, and the mixture of DMPE, DCP, and Chol with molar ratio of 5:1:4 was selected for microfluidic liposome production. Lipid stream, lipid solution in isopropyl alcohol (IPA), was focused by adjacent aqueous sheath flow. Lipid molecules were mixed with surrounding water molecules. Formation of liposome occurred due to the self-assembly of lipid molecules in insoluble solvent. Size distribution and morphologies of produced PE liposomes were characterized by dynamic light scattering (DLS) and transmission electron microscopy (TEM). The average size of produced PE liposomes could be controlled by adjusting FRR. Width of focused lipid stream was decreased with increasing FRR, and thus more lipid molecules can be in contact with surrounding water molecules, resulting in large number of lipid molecules to self-assemble into liposomes of reduced size. Zeta potential of PE liposome dispersion was measured to estimate interparticle interaction and colloidal stability, and it guaranteed sufficient colloidal stability. To understand the diffusive mixing and liposome formation, computational fluid dynamics (CFD) study was performed. Calculated lipid concentration profiles agreed with the experimental data, and fast depletion of lipid with the increase of FRR was observed similar to the result of experiment. Narrow lipid stream and enhanced diffusive mixing due to high FRR increased surface-to-volume ratio, which resulted in fast self-assembly of lipid molecules and production of smaller PE liposomes.
Secondly, bioavailability of PE liposomes was investigated and PE liposomes were used as vaccine adjuvant for PCV2 vaccine. Immunogenicity of PE liposome was verified by enzyme-linked immunosorbent spot (ELISPOT) assay. Peripheral blood mononuclear cells (PBMCs) isolated from blood samples of piglet were stimulated by PE liposomes, and 82.3±17.8 interferon-γ (IFN-γ) secreting cells per million PBMCs were detected. This result was comparable to the result of cell stimulation cocktail, which produced 80±13.6 IFN-γ secreting cells per million PBMCs. From this, the ability of PE liposome that enhances immune response was verified. Vaccination of conventional pigs with liposome-adjuvanted inactivated PCV2 vaccines was studied to confirm the ability of PE liposome enhancing vaccine efficacy. PCV2 infects the monocytes including T lymphocyte which have essential role in immune system. Liposome-adjuvanted inactivated PCV2 vaccine was prepared with inactivated PCV2 virus, and the viral load and lymphocyte populations were measured from blood samples collected once a week after virus infection. Liposome-adjuvanted inactivated PCV2 vaccine induced neutralizing antibodies specific to PCV2 and PCV2-specific interferon-γ secreting cells, and reduced the viral load and infection of T lymphocytes. The performances were better than those of commercial inactivated PCV2 vaccine.
Thirdly, the mathematical model explaining immune responses to PCV2 infection and vaccination was developed using population modeling method. The model was modified through qualitative analysis to fit the simulation to experimental data. The model was solved through dominant parameter selection by global sensitivity and multi-start parameter estimation based on weighted least square objective function. The effects of parameter values or inoculation conditions were investigated. Decreasing clearance rate of adjuvant reduced the period of PCV2 infection, and increased dose of adjuvant accelerated the clearance of virus. This mathematical model would be useful to estimate the dose of vaccine or adjuvant required to achieve virus clearance or the time for virus clearance with vaccination using fixed dose. The computer simulation was also useful to predict relative importance of each factor in immunogenicity. B cell depletion simulation demonstrated that humoral immunity was more dominant than cell-mediated immunity in immune responses to PCV2 infection.
리포좀은 인지질을 수용액에 넣었을 때 자기조립을 통해 인지질 이중층을 형성함으로써 얻어진다. 친수성 기와 소수성 기를 모두 포함하고 있는 인지질의 특성으로 인해 리포좀은 물에 녹는 물질과 기름에 녹는 물질 모두를 전달할 수 있는 물질로 주목 받고 있으며 특히 생물학, 의약학, 그리고 화장품 산업 등에서 활발하게 다뤄지고 있다.
전통적인 리포좀 제조 방법은 먼저 인지질을 유기용매에 녹인 후 용매를 날려보냄으로써 막을 만든 후, 여기에 물을 첨가하여 수화작용을 일으켜 이중막을 형성하고 압출 또는 초음파 처리를 통해 크기를 일정하게 만든다. 하지만 기존의 방법은 생산되는 리포좀의 크기를 조절하는 데에 한계가 있었고, 만들어지는 리포좀의 안정성도 떨어졌다. 이에 본 연구에서는 리포좀을 생산하기 위한 새로운 방법으로 미세유체장치를 이용한 리포좀 생산을 제시하였다. 미세유체역학 (마이크로플루이딕스)은 마이크로미터 수준의 관 내부에서의 유체의 현상을 다루는 학문 분야로 공정을 하나의 칩 안에서 다루는 랩온어칩 기술의 핵심요소이다. 미세유체장치를 이용하면 공정을 소형화할 수 있고, 적은 양의 시료를 이용하여 빠른 반응 속도와 높은 분해능을 얻을 수 있다. 각 채널의 크기, 형태, 그리고 흐름의 유량 등을 손쉽게 제어할 수 있으며 이를 통해 반응 조건을 다르게 할 수 있다.
본 연구에서는 유체역학적 흐름 집속을 이용하여 리포좀을 생산하였다. 중앙 채널에서는 리피드가 녹아있는 아이소프로필알콜이 흐르고, 양 측면에서 물이 공급되어 중앙 흐름과 만나게 되면 층류를 이루고 계면에서 물 분자와 리피드 분자의 혼합이 일어난다. 물 속에 분산된 리피드 분자들이 자기조립을 통해 리포좀을 형성하게 된다. 높은 열 안정성을 보장하는 1,2-dimyristoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine (DMPE)가 주요 성분으로 쓰였고 콜레스테롤은 곡면을 유지시켜주고 동물 세포에 대한 PE 리포좀의 세포 독성을 줄이기 위한 보조 성분으로 사용되었다. Dihexadecyl phosphate (DCP)는 PE 리포좀에 전하를 제공함으로써 안정성을 갖도록 했다. 만들어지는 PE 리포좀의 크기는 물 흐름과 리피드 흐름의 유량비에 따라 결정되었다. 본 연구에서는 물 흐름의 유량을 리피드 흐름의 유량에 비해 10배에서 50배까지 증가시켜가며 PE 리포좀을 생산했으며, 유량비가 커질수록 생산되는 PE 리포좀의 크기는 작아졌으며 크기 분포도 일정해짐을 알 수 있다. 미세유체장치를 이용하여 생산되는 PE 리포좀의 평균 지름을 150 나노미터에서 500 나노미터까지 조절할 수 있었다. 리포좀의 크기는 체내 분해속도와 체내 분포에 영향을 끼치는 중요한 요소로, 미세유체장치를 이용하면 보다 안정한 리포좀 생산과 이로 인한 향상된 전달 효율을 가능케 할 것이 기대된다.
이를 확인하기 위해 PE 리포좀을 이용한 유전자의 전달 연구와, PE 리포좀을 백신 보조약으로 이용하는 연구를 진행하였다. 미세유체장치를 이용한 PE 리포좀 생산과정에서 백신이 포함된 용액을 측면에서 흘려 보냄으로써 백신이 포함된 리포좀 용액을 얻을 수 있었다. 백신 접종 실험은 돼지 써코바이러스 (Porcine circovirus type 2, PCV2) 백신을 이용해 진행하였다. PCV2는 이유 후 전신성 소모성 질병 증후군 (Postweaning multisystemic wasting syndrome, PMWS)의 가장 중요한 원인체로, 돼지 농가에서는 필수적으로 백신 접종을 해야 하는 바이러스이다. PE 리포좀을 포함한 PCV2 백신을 살아있는 돼지에게 접종하였고 백신을 접종하지 않은 경우, 그리고 PE 리포좀이 들어있지 않은 상용 백신을 접종한 경우와 비교하였다. 백신 접종과 PCV2 감염 이후, 혈액 시료를 채취하여 혈중 바이러스 농도, 림포사이트 수치 변화를 측정하였다. 그 결과 PE 리포좀을 넣어준 경우에 바이러스 농도가 가장 빠르게 감소하였고, 바이러스에 의해 감염되는 림포사이트 수치도 다른 군에 비해 적은 것을 확인할 수 있었다. PE 리포좀과 백신을 함께 접종해준 돼지에서 더 많은 수의 항체와 인터페론 감마 생성 세포가 유발됨을 확인할 수 있었고, 이들이 바이러스 농도 감소에 큰 영향을 주었다고 볼 수 있다. PE 리포좀이 백신과 단단히 결합하여 백신의 체내 지속 기간을 늘림으로써 백신의 면역 유발을 보여주는 결과에 의하여 PE 리포좀이 백신 보조약으로 성공적으로 사용될 수 있음을 확인할 수 있었다.
마지막으로 PCV2 감염과 PCV2 백신 접종에 의한 돼지 면역 체계 활성을 수학적 모델링을 통해 모사하였다. 각각의 면역 세포를 모델 변수로, 그리고 그들 사이의 상호작용에 관계된 상수들을 모델 계수로 하여 연립상미분방정식을 세우고 이를 풀었다. 전산 모사 결과는 실험 값을 만족하였고, 실험적으로 알기 어려운 면역 세포들의 수치 변화도 예측할 수 있게 했다. 리포좀의 체내 분해 속도가 면역 활성에 중요한 영향을 미침을 전산 모사 결과를 통해서도 확인할 수 있었다. 실험에서 다룬 것과 다른 조건에서 접종한 경우의 결과 또한 전산 모사를 통해 예측할 수 있었다. 이러한 수학적 모델링 기법은 PCV2와 리포좀을 이용한 본 연구뿐만 아니라 다른 항원과 다른 보조약을 이용한 경우에도 약간의 수정을 거쳐 적용할 수 있다. 수학적 모델링은 새로운 백신의 개발과 백신 접종법의 개발에 도움을 줄 것으로 기대한다.
