Thanks to the extensive researches on fluorescence probe including the invention of immunofluorescence and discovery of green fluoresence protein, fluorescence microscopy has been a popular instrument tool to understand properties organic and inorganic specimens. However, due to the diffraction limit, conventional fluorescence microscopy cannot discern details of specimen that are closer than half of wavelength of emission light. Recently, far-field fluorescence microscopy to overcome the diffraction limit has been extensively studied. For example, stimulated emission depletion microscopy (STED) exploits stimulated emission phenomenon of fluorescence material to design sharp effective point spread function (PSF), by suppressing the rim of excitation spot. Saturated structure illumination microscopy (SSIM) can unlock the diffraction limit by high power parallel line pattern illumination which drops high order frequency components onto range of optical transfer function (OTF) as the similar way of structured illumination microscopy (SIM). In single molecule based approach such as STORM and PALM/FPALM, photoswitchable fluorescence molecule is used for super resolution localization. However, all these super resolution techniques have their own limit such as requirement of high power laser and massive hardware setup or specific photoswitchable dye. Here, we propose a novel 3D multi-color super resolution microscopy, called nanometer resolution imaging method using speckle illumination and multiple signal classification (Nano-MUSIC). The novelty of Nano-MUSIC is that it can achieve super resolution image by using array signal processing technique and speckle illumination, by converting super resolution image to multiple source localization problem. Using Nano-MUSIC with focus stabilization, we demonstrate the multi-color 3D imaging with biological sample such as microtubule, mitochondria, F-actin to discover the sub-diffraction-scale details of cellular structures.
본 연구에서는 기존 광학계의 회절 한계를 뛰어넘는 초고해상도 다색 삼차원 형광영상 기법을 제안한다. 형광 현미경은 면역형광법 개발과 형광단백질 발견을 통한 형광프로브에 관한 폭넓은 연구덕분에 세포의 형태와 동작원리를 밝히는 데 유용한 툴로 자리잡았다. 하지만 기존의 형광 현미경은 회절한계로 인하여 발생하는 형광 파장의 절반 이하의 작은 세포 내 구조를 구별하는 것이 불가능 했다. 최근 10년간 기존의 회절한계를 뛰어넘는 원거리 형광 영상 기법이 폭 넓게 연구되었다. 대표적인 예로 STED는 뾰족한 유효 점 퍼짐 함수를 만들기 위해 형광물질의 유도방출을 이용하였다. 또한 SSIM은 여러 개의 선형 무늬 조명을 통해 초고해상도 영상을 얻었다. 또 다른 방법으로 STORM/PALM은 단일 분자 영상기법과 광학적으로 키고 끌 수 있는 형광프로브를 이용하여 기존의 회절 한계를 뛰어넘는 초고해상도 영상을 얻었다. 하지만 이런 기술들은 각자 다른 한계점들을 가지고 있다. 예를 들어 STED와 SSIM은 세포에 유해할 수 있는 강한 조명과 그에 따른 제한된 형광프로브 그리고 정교하고 복잡한 광학계의 설치가 필요하다. 또한 STORM/PALM은 광학적으로 키고 끌 수 있는 형광물질을 기반하므로 일반적인 형광물질을 사용할 수 없다. 이러한 제약은 초고해상도 형광영상 기법의 대중화를 저해하는 요소가 된다. 따라서 기존의 형광현미경의 기법을 사용할 수 있는 초고해상도 영상기법의 개발이 요구되었다. 본 연구에서는 스페클조명과 배열신호처리기법을 이용하여 초고해상도 다색 삼차원 영상을 복원하였다. 제안한 방법은 초고해상도 영상복원을 여러 신호원의 위치 추적문제로 전환하여 기존의 형광 현미경에서 사용하던 형광물질을 모두 사용 가능한 초고해상도 형광영상기법이다. 자세히는 스페클조명을 통해 각 형광물질이 시간에 따라 무작위로 발광되며 이를 부분공간 기반 배열신호처리 기법 중 하나인 MUSIC 방법을 통해 초고해상도 영상을 복원하였다. 추가적으로 다색 초고해상도 영상복원을 위해 초점면을 유지시키는 방식을 개발하였다. 제안한 방법은 미소관, 미토콘드리아 그리고 액틴이 염색된 HeLa 세포에 적용하여 성능을 평가하였고 다색 삼차원 초고해상도 영상이 최대 수평 해상도 65nm로 복원됨을 보였다.
