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Peroxidase deoxyribozyme-based biosensors for the detection of nucleic acids and proteins = Peroxidase활성을 가지는 DNA기반의 핵산 및 단백질 진단 바이오센서
서명 / 저자 Peroxidase deoxyribozyme-based biosensors for the detection of nucleic acids and proteins = Peroxidase활성을 가지는 DNA기반의 핵산 및 단백질 진단 바이오센서 / Rongzhan Fu.
저자명 Fu, Rongzhan ; Fu, Rongzhan
발행사항 [대전 : 한국과학기술원, 2011].
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Sensors are devices at least comprising of two components: target recognition and signal transduction, which respond to physical or chemical stimuli and produce readout signals. The development of highly sensitive and selective sensors to recognize important analytes has long been a focus of research of many areas, including environment monitoring, industrial quality control, and medical diagnostics. Since a large number of deoxyribozymes (DNAzymes) have been selected in vitro, various biosensors have been developed by utilizing DNAzymes as the signal transduction components owning to their catalytic activity, and many unique advantages over the protein enzymes, such as great flexibility, high stability, cost-effectiveness, easy synthesis, and facile modification. An interesting DNAzyme is horseradish peroxidase-mimicking DNAzyme that is a complex of guanine-rich DNA strand and hemin catalyzing H2O2-mediated oxidation of substrate producing colorimetric or chemiluminescens readout signals. By combining these peroxidase-mimicking DNAzymes with nanoparticles, DNA probes, molecular beacons, and aptamers, we have developed various novel biosensors for the detection of nucleic acids, small molecules, and proteins. In the first strategy, we constructed two types of oligonucleotide-modified nanoparticles, one being a gold nanoparticles (AuNPs) modified with both capture DNAs and peroxidase DNAzymes and the other a magnetic nanoparticles (MNPs) modified with another capture DNA for the ultrasensitive detection of the target DNA. In presence of the target DNA, AuNPs associate with the MNPs by forming sandwich complexes. After magnetic separation, the result complexes were separated from the unreacted nanoparticles, and subsequently the peroxidase DNAzymes on the AuNPs catalyze the oxidation of ABTS generating a green colorimetric signal. This DNAzyme-based colorimetric assay allowed the highly sensitive detection and separation of nucleic acids down to femtomolar level. Furthermore, this assay demonstrated great potential in analyzing and separating other biological molecules. The second biosensor we designed was a novel DNAzyme molecular beacon (DNAzymeMB) for target-induced signal amplifying colorimetric detection of target nucleic acids. The DNAzymeMB, which exhibits peroxidase activity in its free hairpin structure, was engineered to form a catalytically inactive hybrid through hybridization with a blocker DNA. The presence of target DNA leads to dissociation of the DNAzymeMB from the inactive hybrid through hybridization with the blocker DNA. This process results in the recovery of the catalytically active DNAzymeMB, which can catalyze a colorimetric reaction that signals the presence of the target DNA. In addition, a primer was rationally designed to anneal to the blocker DNA of the blocker/target DNA duplex and displace the bound target DNA during the extension reaction. The released target DNA triggers the next cycle involving hybridization with blocker DNA, DNAzymeMB dissociation, primer extension and target displacement. This unique amplifying strategy leads to the generation of multiple numbers of active DNAzymeMB molecules from a single target molecule, and gives a detection limit down to 1 pM, a value that is nearly three or five orders of magnitude lower than those of previously reported DNAzyme molecular beacon-based DNA detection methods. Also our method displays a high degree of specificity for distinguishing non-specific target DNA and single-nucleotide mismatched target DNA. Furthermore, an isothermal enzyme-mediated amplification strategy was developed which could further enhanced the sensitivity of the hybrid probe of DNAzymeMB/blocker for DNA detection. The addition of target DNA dissociated catalytically active DNAzymeMB and uncovered a primer binding site within the blocker DNA. A primer containing a nicking enzyme recognition sequence consequently annealed to the blocker DNA inducing the extension of the primer and the blocker DNA at their 3’ end, respectively. The extension of primer enabled the synthesis of a complementary DNA strand of the blocker DNA realizing the target DNA recycling. Simultaneously, the extension of the blocker DNA activated the nicking enzyme recognition site triggering a nicking, polymerization, and displacement cycle to replicate multiplex copies of signal-stranded DNAs that contain the same sequences with the part target DNAs. Therefore, a large number of catalytically active peroxidase DNAzymeMB was free by both the recycled target DNA and newly synthesized ssDNA, consequently amplifying the resulting colorimetric signals. This enzyme-mediated amplification strategy possesses an ultrahigh sensitivity with a detection limit in attomolar range, and is able to detect the real sample of genomic DNA requiring no PCR amplification. Finally, a novel aptasensor was designed that is a duplex of a peroxidase DNAzymeMB and a blocker DNA containing an aptamer sequence. In the absence of target proteins, the DNAzymeMB was partially hybridized with the blocker DNA and lost its catalytic activity. Upon the addition of the target proteins, the formation of the protein- aptamer complex released the catalytically active DNAzymeMB from the aptasensor producing amplified colorimetric signals. This aptasensor can be further associated with polymerization and nicking reactions by using a primer containing a nicking enzyme recognition sequence. In this advanced strategy, the recognition of target protein frees catalytically active DNAzymeMB molecules, simultaneously triggers an isothermal enzyme-based amplification cycle. Through this amplification cycle, target proteins were recycled, and multiple copies of ssDNA were synthesized that is partially complementary to the blocker DNA, resulting in the release of an enhanced number of catalytically active DNAzymeMBs. As a result, the sensitivity of this protein detection strategy was significantly increased, with a detection limit of 0.1 fM for analyzing lysozyme which is 100-folded improved as compared to the previous reported DNAzyme-based aptasensors.

DNA효소(DNAzyme)는 단백질 효소와 구분되는 특유의 촉매활성을 갖는 DNA로서 바이오센서에 증폭된 시그널을 제공하는 하나의 시그널 라벨로 활용된다. DNA효소는 단백질 효소보다 여러 가지 고유의 장점들이 있는데 예를 들면 높은 열안정성, 간편한 제작 및 수식, 그리고 특정서열을 인식할 수 있는 특징을 갖고 있다. DNA효소의 이러한 우수한 특징들을 이용하여 현재까지 DNA효소들을 이용한 많은 바이오센서들이 개발되어 광범위한 분야에 응용되고 있다. 본 연구에서는 시그널을 변환시키는 요소로 작용하는 과산화효소 활성을 갖는 DNA효소를 이용하여 여러 가지 색전이 바이오센서를 개발하였다. 타겟 물질인 핵산을 검출하기 위하여 본 연구에서는 DNA 효소와 capture DNA가 수식된 새로운 나노입자 탐침을 개발하였다. 또한, 과산화효소 활성을 갖는 DNA효소-분자 비콘(DNAzyme-Molecular beacon, DNAzymeMB)을 새롭게 디자인하여 가닥교체 중합과 고유 효소에 의한 증폭에 응용하였다. 더 나아가서, DNA효소에 기초한 aptasensor를 개발하여 단백질 검출에도 응용하였다. 이와 같은 주제들을 아래와 같이 간략히 요약하였다. 1) 본 연구에서는 DNA효소를 이용한 새롭고 ultrasensitive한 방법으로 목적 올리고를 검출하는데 성공하였으며, 이 방법에서는 올리고뉴클레이티드로 수식된 두가지 유형의 나노입자를 합성하여 목적 올리고 검출에 사용하였다. 하나는 capture DNA와 과산화효소 활성을 갖는 DNA효소가 수식된 금나노입자이고, 다른 하나는 다른 capture DNA가 수식된 자성나노입자이다. 목적 DNA가 존재할 시, 서로 다른 capture DNA가 수식된 금나노입자와 자성 나노입자가 sandwich 혼합물을 형성하게 되는데, 이때 금나노입자에 높은 비율로 존재하는 DNAzyme에 의해 색전이 시그널이 증폭됨으로써 목적 올리고에 대해 높은 특이성을 나타낸다. 탐침 DNA 대신 aptamer을 이용하면 본 연구에서 개발한 이 방법으로 핵산뿐 아니라 많은 여러 가지 target 물질들을 검출할 수 있을 것이다. 2) 본 연구에서는 분자 비콘과 DNA효소로 과산화효소 활성을 갖는 DNA효소-분자 비콘 (DNAzyme molecular beacon, DNAzymeMB)를 개발하였다. 이 DNAzymeMB는 blocker DNA와 혼성화함으로써 촉매활성이 억제된 탐침이 만들어지는데 이러한 원리를 이용하여 다른 촉매 비콘 탐침들보다 목적 DNA를 높은 민감도로 검출할 수 있었다. DNAzymeMB/blocker 혼성화된 탐침과 등온중합반응을 결합하면 목적 DNA는 계속 재활용됨으로써 궁극적으로 DNA 검출에 매우 높은 민감도를 제공할 수 있다. 3) 본 연구에서는 등온효소를 통한 증폭방법과 과산화효소 활성을 갖는 DNAzymeMB/blocker을 이용하여 목적 핵산을 검출하는 시스템을 개발하였다. 이 증폭방법은 중합효소에 의한 목적 DNA의 재활용, nicking 효소에 의한 목적 DNA의 부분적인 서열 증폭을 통하여 지속적으로 색전이 반응을 촉진하는 것이다. 여기서 nicking 효소에 의해 생성된 목적 DNA의 부분적인 서열은 과산화효소 DNAzymeMB 분자를 활성화시키는 역할을 한다. 이 방법은 민감도가 훨씬 증강되었는데 이는 바로 목적 DNA의 재활용, DNAzymeMB의 촉매활성 증폭, 그리고 DNA효소에 의한 색전이 시그널의 증폭 때문이다. 이러한 초민감도 검출방법으로 병원균을 검출할 수 있을뿐더러 또한 목적 DNA를 PCR 증폭 없이 정량 할 수 있다. 4) 본 연구에서는 Aptamer와 DNAzymeMB이 결합된 aptasensor을 개발하여 목적 단백질이 존재할 시, DNAzymeMB의 촉매역할을 활성화 시킴으로써 색전이 시그널을 생성하게 한 것이다. 더 나아가서, 등온효소에 의한 증폭을 통한 단백질의 검출에도 성공하였는데 이는 aptamer와 효소에 의해 증폭되는 메커니즘을 활용한 것이다. 동시에, 목적 단백질을 인지하는 aptasensor는 효소에 의한 증폭반응을 야기시키는데 이는 단일 가닥의 DNA를 복제하게 되며, 이 단일가닥의 DNA는 촉매 DNAzymeMB를 활성시킨다. 이 등온 효소에 의해 증폭된 단백질의 검출방법은 target의 재활용, 탐침의 증폭, 시그널의 증폭과 함께 높은 민감도를 제공해준다.

서지기타정보

서지기타정보
청구기호 {DCBE 11028
형태사항 xi, 87 p. : 삽도 ; 30 cm
언어 영어
일반주기 저자명의 한글표기 : Rongzhan Fu
지도교수의 영문표기 : Hyun-Gyu Park
지도교수의 한글표기 : 박현규
학위논문 학위논문(박사) - 한국과학기술원 : 생명화학공학과,
서지주기 References : p. 77-79
주제 DNAzyme
Aptamer
Nucleic acid
Protein
Detection
DNAzyme
Aptamer
핵산
단백질
진단
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