Non coding RNA (ncRNA) is a class of RNAs that function without being translated into protein. Above all, antisense RNA is a type of ncRNA that complementarily binds with mRNA to regulate its translation. But, all experimental papers have been confined to sRNA’s specific target region and whole mRNA region scanning has not been done and there have never been efficiently controlled study considering their antisense RNA’s structure. Therefore an artificial small RNA (afsRNA) scaffold which was designed from an Escherichia coli sRNA, SibC was made. Using the lacZ reporter system, the gene silencing effects of afsRNAs were examined to explore the sRNA-mediated gene silencing mechanisms in E. coli. Substitution of the original target recognition sequence with a new sequence recognizing lacZ mRNA led to effective reduction of lacZ gene expression. Single-strandedness of the target recognition sequences in the scaffold was essential for effective gene silencing. The target recognition sequence was shortened to 10 nt without significant loss of gene silencing, although this minimal length was limited to a specific target mRNA sequence. In cases where afsRNAs had mismatched (forming internal loops) or unmatched (forming bulges) regions in the middle of the target recognition sequence, internal loop-forming afsRNAs were more effective in gene silencing than those that formed bulges. Unexpectedly, gene silencing by afsRNA was not decreased, but increased upon hfq disruption in E. coli, particularly when interactions between afsRNA and mRNA were weak, suggesting that Hfq is possibly involved in destabilization of the RNA-RNA duplex, rather than enhancement of base pairing. And then, the idea that the translation initiation region (TIR) is usually targeted by sRNA was confirmed in vivo by antisense RNA stabilizing skills. To do so, twenty three artificial ncRNAs containing antisense regions to target mRNA were designed with double stem-loop stabilized structure, to examine how much the designed ncRNAs regulate target mRNA translation. The ncRNAs were tested their effectiveness in the lacZ reporter system to show whether the position of ncRNA’s target is good for repression of translation. This result was also confirmed by analyzing mRNA with northern blot. And serendipitously, Hfq’s new function was found that Hfq also has disturbing effect to silencing by antisense RNA by capturing, holding and keeping it back even though it has stabilizing effect too.
박테리아에서 포유류에 이르기까지 단백질을 코딩하지 않는 RNA (noncoding RNA: ncRNA)가 계속적으로 발견되고 있고, 지금까지 생각하지 못하였던 다양한 기능이 밝혀지고 있다. 대장균에서는 지금까지 약 100여종의 작은 ncRNA (small ncRNA, 보통 sRNA라 부름)의 존재와 일부 기능들이 밝혀졌다. 이들 기능 중에서 번역 또는 타겟 mRNA의 안정성의 조절이 가장 일반적인 기능이다. 이러한 조절은 sRNA와 mRNA사이의 염기 쌍 형성을 통한 RNA-RNA 상호작용으로 일어나는데, 이러한 상호작용은 sRNA가 세포내 많은 RNA 중에서 타겟 mRNA 만 특이적으로 결합하는 것을 가능하게 한다. 그러나 실제로 세포내에서 RNA-RNA 상호작용을 정확하게 조사하는 것은 매우 어렵다. 그 이유는 세포내에서 염기쌍 형성 과정은 매우 오묘하고 종종 예상치 못한 방법으로 진행되는 반응이기 때문이다. sRNA와 mRNA의 상호작용은 보통 타겟 mRNA의 번역을 억제하기 때문에 이러한 번역 억제 작용을 유전자 침묵이라 한다. 대장균에서 sRNA에 의한 유전자 침묵은 Hfq를 포함하는 복합체에 의하여 매개된다고 생각하고 있다. 세포 내 많은 RNA 중에서 타겟 mRNA 만 선택적으로 인식하는 sRNA의 특이성은 염기 쌍 형성, 접근 성, RNA 샤프론 단백질과 같은 다양한 인자들에 의하여 결정된다. 이 때문에 세포내에서 sRNA가 타겟 mRNA를 인식하는데 필요한 염기쌍의 개수는 물론, 이를 통한 sRNA의 특이성을 결정하는 메커니즘은 아직까지 불분명하다. 그럼에도 불구하고 타겟 mRNA를 구별할 수 있는 sRNA의 특이성은 염기쌍의 갯수에 의해 결정된다는 것이 일반적인 견해이다. 자연에 존재하는 sRNA와 mRNA 사이의 형성되는 염기쌍은 보통 연속적으로 있지 않기 때문에 이러한 sRNA를 이용하여 정확한 RNA-RNA 상호작용을 예측하기가 어렵다. 그러므로 본 연구에서는 정해진 타겟 인식 염기서열을 갖는 인공 sRNA (artificial sRNA: afsRNA)를 개발하고, 이를 이용하여 유전자 침묵에 작용하는 sRNA의 특이성을 결정하는 메커니즘을 밝히고자 하였다.
afsRNA의 원형은 대장균 sRNA인 SibC의 TRD2 (target recognition domain 2)를 포함하는 RNA 골격을 이용하여 제작하였다. SibC는 TRD2를 통하여 타겟인 ibsC 독소 유전자의 번역을 억제한다. SibC의 유도체인 SibC(1-8::77-141) 골격안에 17 누클레오티드의 TRD2를 갖고 있기 때문에 이 TRD2를 리포터 유전자 mRNA의 염기순서 (sequence)을 인식하는 새로운 염기순서로 바꿀 수 있도록 하였다. 리포터 유전자로서는 lacZ 유전자를 이용하였고, β-갈락토시드가수분해효소 (β-galactosidase)의 활성을 관찰함으로 afsRNA에 의한 유전자 발현 억제를 조사하였다. 먼저 lacZ mRNA의 번역 개시점 (+1)을 기준으로 -17에서 +l 까지의 염기순서에 상보적인 염기순서를 SibC(1-8::77-141)의 TRD2와 치환하여 이 부분을 타겟인식 염기순서 (target recognition sequence)로 하는 ARlacZ1을 제작하였다. TRD2의 치환 이외에도 afsRNA 골격의 이차구조를 유지하기 위하여 필요한 염기들도 변화시켜 주었다. ARlacZ1와 SibC(1-8::77-141)의 이차구조 분석을 통하여 TRD2 염기순서를 치환하여도 같은 RNA 골격을 유지한다는 것을 확인하였으며 디자인된 afsRNA은 대장균에서 IPTG 유발 벡터인 pHM-tac을 이용하여 발현시켰다.
afsRNA인 ARlacZ1의 발현을 IPTG로 유발시켰을 때 β-갈락토시드가수분해효소의 활성이 20%로 감소되는 것을 관찰하였다. 이러한 발현 감소는 세포내 존재하는 afsRNA 농도와 비례하였다. 박테리아 개체 하나에 존재하는 afsRNA와 mRNA의 개수를 정량하여 효율적인 유전자 침묵을 위하여 lacZ mRNA 보다 afsRNA가 15배 정도는 많아야 된다는 것을 밝혔다. afsRNA 골격에서 타겟인식 염기순서의 대부분은 J1/7 영역에 존재하는데 이 부분은 단일가닥 영역이다. 타겟인식 염기순서를 줄기 (stem) 구조를 포함하는 영역에 치환하였을 때는 유전자 침묵 효과가 낮았다. 이 결과는 타겟인식 염기순서의 단일가닥성의 중요성을 보여 주는 결과이다.
afsRNA에서 단일 가닥 영역에 타겟인식 염기순서가 있을 때 유전자 발현 억제 능력이 가장 크다는 것을 알았기 때문에 이 영역의 타겟 염기순서를 줄여가면서 효과적인 유전자 침묵을 위하여 필요한 염기쌍을 결정하였다. 타겟인식 염기서열을 21개에서 9개로 줄이면서 유전자 침묵 정도를 조사하였다. 11 또는 10로 줄였을 때 까지도 유전자 침묵 정도가 아주 조금은 약해졌지만 여전히 효과적인 유전자 침묵을 관찰 할 수 있었다. 그러나 9개로 줄였을 때 이러한 유전자 침묵에 의한 유전자 발현 억제가 나타나지 않았다. 이 결과는 10개의 염기쌍이 유전자 침묵을 위하여 충분하다는 것을 시사하여 주지만 타겟 염기순서를 다른 영역으로 옮겼을 때는 그렇지 않았다. 그러므로 유전자 침묵에 필요한 최소 염기쌍은 mRNA 상에서 타겟 염기순서의 위치에 영향을 받을 수 있다.
자연계에 존재하는 sRNA은 많은 경우에 타겟 mRNA와 부분적으로 잘못 짝지은 영역을 포함하고 있다. 이러한 잘못 짝지음에 의하여 sRNA와 mRNA 사이에 형성된 RNA 혼성체는 RNA 이중가닥 이외에 내부 고리 (internal loop) 또는 돌출부 (bulge) RNA 구조를 형성할 수 있다. 내부 고리를 형성할 수 있는 afsRNA (14L 시리즈)가 돌출부를 형성 할 수 있는 afsRNA (14B 시리즈) 보다 더 효율적이라는 것을 관찰하였다. 또한 전체 염기쌍 형성 개수는 같아도 잘못 짝지음 영역이 길수록 효과적인 유전자 침묵을 할 수 없다는 것을 관찰하였다.
Hfq 단백질은 sRNA와 타겟 mRNA 사이의 염기쌍 형성을 증진시키는 역할을 하는 것으로 알려져 있지만 아직 정확한 메커니즘은 불분명하다. afsRNA에 의한 유전자 침묵현상이 Hfq에 의하여 영향을 받는지를 조사하기 위하여 hfq- 균주에서 afsRNA에 의한 β-갈락토시드가수분해효소 활성의 변화를 조사하였다. 23개에서 9개까지 다양한 길이의 타겟인식 염기순서를 가지고 있는 afsRNA 들에 의한 유전자 침묵을 조사하였다. 타겟인식 염기순서의 길이가 23개에서 12개까지의 afsRNA는 차이를 나타내지 않았다. 그러나 타겟인식 염기순서가 11개, 10개, 9개로 줄어들었을 때 hfq- 균주에서 β-갈락토시드가수분해효소의 활성이 더 줄어드는 것을 관찰하였다. 특히 타겟인식 염기순서가 9개인 afsRNA는 hfq+ 균주에서는 유전자 침묵을 야기 시키지 않았지만 hfq- 균주에서는 유전자 침묵을 야기 시켰다. 이 결과는 타겟인식 염기순서의 최소 염기 수에 못 미치는 경우 Hfq는 이러한 염기쌍 형성을 증진하기 보다는 방해한다는 것을 시사한다. 이러한 Hfq의 기능은 약한 염기쌍 형성에 의한 유전자 침묵현상을 억제함으로써 유전자 침묵의 특이성을 증진시키데 중요한 역할을 할 것으로 예상할 수 있다.
전체 mRNA 안에서 번역개시지역이 유전자 침묵에 가장 유리한 지역이라는 것을 조금 더 안정성을 향상시킨 이중 기둥-고리 이차구조 RNA 틀을 이용한 동일한 실험으로 확인할 수 있었고, 추가적으로 Hfq는 sRNA에 결합하여 안정성을 향상시키기도 하지만, 발현억제에 사용될 sRNA가 Hfq에 결합하여 빠져 나오지 못하게 될 경우도 있어서 발현 량이 적을 때는 Hfq가 유전자 침묵효과에 역 기능을 할 수도 있음을 밝힘으로 상보염기 RNA의 연구를 통해 Hfq의 밝혀지지 않았던 기능에 대해 첫 발걸음을 내딛게 되었다.
염기쌍이 약할 때 유전자 침묵의 억제하는 Hfq의 기능은 짧은 염기쌍 형성으로 원하지 않는 타겟인식에 의하여 야기될 수 있는 sRNA의 과녁을 벗어난 효과 (off-target effect)를 감소시키는 역할을 할 지 모른다. 그러므로 이러한 연구 결과는 세포내에서 RNA-RNA 상호작용을 통하여 일어나는 sRNA의 작용메커니즘을 좀 더 깊이 이해하는데 기여할 수 있다. 또한 본 연구에서 개발한 afsRNA는 세포내에서 RNA-RNA 상호작용을 조사하는데 유용한 도구로 사용될 수 있다. 예를 들어 어떤 sRNA의 타겟 인식 염기서열을 afsRNA 골격에 편입시킨다면 정확한 타겟인식 염기서열을 검증하는데 사용할 수 있다. 더욱이 afsRNA는 진핵생물에서의 유전자 침묵과 같이 원핵생물에서 정교하게 유전자 침묵을 할 수 있는 실험적 기술을 제공할 수 있기 때문에 학술적인 측면에서 유전자 넉아웃 (knockout)을 만들 수 없는 필수유전자 (essential gene)의 경우 유전자 넉다운 (knockdown)을 통하여 세포내 유전자의 기능을 밝힐 수 있을 뿐 아니라, 응용적 측면에서도 이 기술을 대사공학에 효과적으로 활용할 수 있을 것으로 예상된다.
