Glyoxal is toxic and mutagenic α-oxoaldehyde generated in vivo as an oxidation by-product of sugar metabolism. We selected glyoxal-resistant mutants from E. coli strain lacking major glyoxal-detoxifying genes, gloA and yqhD, by growing cells in media containing lethal concentration of glyoxal. The mutants car-ried diverse genomic rearrangements, such as multibase deletions and recombination, in the upstream region of yafB gene, encoding an aldo-keto reductase. Since these genomic lesions create transcriptional fusions of yafB gene to the upstream rrn regulon or eliminate a negative regulatory site, the mutants generally enhanced an expression of yafB gene. Glyoxal resistances of the mutants are correlated with the levels of yafB tran-scripts as well as the activities of aldo-keto reductase. An overproduction of YafB in the glyoxal-resistant mutant lacking the putative NsrR binding site provides an evidence that the yafB gene is negatively regulated by this protein. We also observed that the expression of yafB is enhanced with an increased concentration of glyoxal as well as a mutation in fnr gene, encoding a putative regulator. The bindings of NsrR and Fnr to the yafB promoter were also demonstrated by gel mobility shift assays.
Glyoxal (글리옥살, GO)은 미생물은 물론 고등진핵생물에 이르는 다양한 생명체에서 대사과정 중 축적되는 유독한 대사산물로서 세포 내 고분자들과의 강한 반응성을 가지며 핵산과 반응하여 돌연변이유발물질로서도 작용한다. 이러한 GO는 다양한 효소적, 비효소적 경로를 통해 해독된다. 본 연구에서는 GO와 같은 독성 알데히드를 제거하는 대표적 효소인 글라이옥살라아제 (glyoxalase I)와 알데하이드 환원효소인 YqhD를 모두 제거하여 GO에 대해 매우 큰 민감성을 가진 대장균 K-12를 모균주 (parent strain) 로 사용하여 GO가 포함된 배지에서의 배양을 통해 GO에 강한 저항성을 가진 돌연변이주를 분리하였으며, 저항성을 유발한 돌연변이를 찾아내어 분석하였다. GO에 내성을 가진 균주들은 모두 대장균 Aldo-keto reductase (AKR)중의 하나인 YafB를 과발현 하고 있었으며 그와 동시에 전위인자 (transposon)를 표시인자로 사용한 동시형질도입 (cotransduction frequency)을 실시한 결과 모든 돌연변이가 yafB 유전자의 근처에 존재함을 알게 되었다. 또한, DNA 염기배열 분석을 통해 yafB의 단백질 암호화 부위의 상류에 다양한 길이의 결실과 상동재조합을 포함한 DNA의 재배열이 일어났음을 알게 되었다. 이러한 돌연변이주를 돌연변이 종류와 내성 정도에 따라 총 다섯 가지로 분류하였으며 각각의 GO에 대한 저항성은 YafB의 발현양에 비례하여 증가함을 확인하였다. 이러한 내성균주의 돌연변이들이 yafB의 과발현으로 인한 GO에 대한 내성에 어떻게 기인하는지를 알아보기 위해 전사수준에서의 실험들을 실시한 결과, 첫째, 전사종결자 등의 전사조절 구조가 다염기결실 (multibase deletion)이나 rRNA 오페론 사이의 상동재조합으로 인해 제거 됨으로 인하여 yafB의 상류의 rRNA 프로모터로부터 시작되는 강한 전사흐름에 의해 YafB의 과발현이 유도되어 GO에 강한 내성을 갖는 경우, 둘째, yafB 유전자의 발현을 억제하는 전사억제단백질 (transcriptional repressor)이 결합하는 결합부위에 결실이 생겨 YafB의 과발현이 유도된 경우의 두 가지 유형으로 나눌 수 있었다. 전사억제단백질의 경우 GO에 내성을 갖는 균주로부터 발견한 NsrR과 유전자서열분석을 통해 발견한 Fnr 모두 yafB의 전사억제자로서 직접 작용하고있음을 in vivo 와 in vitro 실험을 통해 확인할 수 있었다. 또한, 유전자 결실 및 상보성 실험을 통해 대장균 AKR인 YafB가 생체 내 GO의 해독을 위한 글루타티온 (glutathione) 비의존적 경로로서 매우 중요함을 확인하였다.
