Due to unique optical and electrical properties, such as broad excitation region, narrow emission area, tunable optical properties, strong luminescence, and excellent
photostability compared to conventional organ-ic dyes, luminescent semiconductor quantum dots (QDs) have been utilized in wide applications in biology such as
biological imaging, DNA detection, multiplexing beads, and efficient donors in fluorescence (Forster) resonance energy transfer (FRET) mechanisms. Recently, the QDs-
metal nanoparticle (NP) composites have offered highly promising potential applications in nanotechnology and biotechnology because of their interest-ing properties,
such as fluorescence enhancement and quenching effects. Considerable theoretical and experi-mental effort is being made to understand the mechanisms of the
photoluminescence (PL) enhancement and quenching phenomenon for QDs-metal composites. However, understanding on the mechanism and potential applications of the
fluorescence quenching phenomenon is still very limited. Properties of the QDs-metal com-posites have been performed in a solid state. For real biological
applications, the QDs-metal composites with unique optical properties should be available in a water solution, while there have been only a few research works on the
composites dispersed in a water solution. Even though some research had worked on the optical properties in aqueous solution, it is still not enough to systematically
understand the quenching and enhance-ment mechanisms in our own QDs-metal system. The aims of this research are to gain deep understanding of PL quenching and
enhancement dynamics in QDs-metal composites, and to obtain a new protein chip detection system with high sensitivity and low limit of detection (LOD) by using QDs-
metal composites.
The first study in this dissertation is to investigate the fluorescence dynamics of QDs-metal compo-sites. We indicated a systematical study of optical properties,
especially the quenching mechanism of QDs in the absence and presence of gold nanoparticles (Au NPs) in water solution. The amine functionalized CdSe/ZnS QDs and the
citrate ions absorbed Au NP interact by electrodynamics interaction. Relative PL, rela-tive PL excitation, and time-resolved PL analysis revealed the contributions of
the Forster resonant energy transfer (FRET) and the surface plasmon (SP) enhancement processes in the PL quenching. We found that the quenching phenomenon is affected
by interplay of the FRET and SP enhancement processes of QDs-Au NP composites in aqueous solution. We carefully controlled the conditions during the fabrication and
characterizations of QDs-Au NP composites to consider possible influences in PL quenching: i) Various sizes of QDs and different excitation wavelengths are used to
consider the size-dependent PL properties; ii) Inner filter effect, which contains the influences of Au NPs on the excitation beam and the emission of QDs by
absorption, are considered. iii) The interaction between QDs and Au NPs has also been confirmed by PL intensity recovery after adding sodium chloride, and it is indeed
responsible for the quenching in the QDs-Au NP composites solution
According to the consideration of the quenching and enhancement mechanisms, we designed our SPR and SPCE measurements to detect real protein chips by using QDs-metal
composites for obtaining high detect-ing sensitivity and low LOD. It is well known that clinical outcome of cancer diagnosis is highly dependent on the stage at which
the malignancy is detected and therefore early screening which related to the detection sensitivity is extremely important in any type of cancer. In recent researches,
a limit of detection for biomolecules (i.e. prostate specific antigen, PSA for short) was achieved as low as dozens of femtomolar (fM) by using surface plasmon-
enhanced fluorescence spectroscopy method in the fluorescence-based detection. However, for medical diagnostic applications, biological samples often contain attomolar
or few fM concentrations of biomolecules, which is lower than the currently achieved limit of detection. Increasing the sensitivity for ultrasensitive analysis of
analytes has been an active area of research in biotechnology. In this part, we demonstrated the QDs-based PSA cancer protein biochips by using surface plasmon-coupled
emission measurements (SPCE) for the first time. Here, a 5 nm SiO2-protected 50 nm gold thin film on BK7 glass is used as substrate, and PSA antibodies (Abs) are
conjugated with pegylated QDs. We achieved a limit of detection as low as 10 fg/mL (equal to 0.3 fM). It was 100 times better than the earlier report, in which the
organic dyes were used as fluorescent probes and the LOD was 34 fM. The key point for this high sensitivity is the excellent brightness of QDs, which is proportional
to the extinction coefficient (ε, molar absorbance) and quantum yield (Φ) of the fluorophore, εXΦ The brightness of the QDs is 20-40 times higher than the
commonly used organic dyes, and the high brightness of QDs allows the decrease of the quantity of fluorescent labels, consequently, limits the nonspecific binding.
Also, we measured these protein chips to obtain the images and spectra of surface plasmon resonance (SPR) dispersion curves by using SPR technique. We can detect the
PSA protein chips with the concentration of PSA as low as 100 fg/mL by using SPR setup. In our experiment, the SPCE and SPR signals can be obtained with high
sensitivity and low LOD at the same time. Our results suggest a great potential for fabricating and detecting various cancer proteins which are present in very low
concentrations within the human body by labeling QDs as fluorescence probes. Furthermore, we are working on improving the detection sensitivity to gain lower LOD for
QDs-based protein chips by using SPCE measurement in present of Au NPs.
발광 반도체 양자점들은 상업적인 유기 염료들에 비하여 우수한 광안정성과 넓은 여기 영역, 좁은 흡수 영역, 형광공명에너지 전달 (FRET) 메커니즘에서의 효율적인 donor 역할 등 독특한 광학적, 전기적 특성을 가지고 있어 나노 공학과 바이오 레벨링, DNA 검출, 복합 비즈, 같은 바이오 공학 분야에서 매우 큰 관심을 끌어 왔다. 또한, 독특한 광학적, 화학적 특성 때문에 금 나노 입자같은 금속 나노 입자들은 광탐침, 표적 약품 전달, 프로그램화된 물질 합성 등 많은 바이오 나노 공학의 응용에 매우 적합하다. 최근 이러한 양자점-금속 합성물 제작 시, photoluminescence (PL) 향상 효과와 소거 효과같은 흥미로운 특성이 발견되어 바이오 공학에 있어서 매우 다양한 응용성을 보여주고 있다.
본 논문의 첫 번째 주제는 양자점-금속 복합 구조체의 동력학적인 발광 특성과 같은 기초 특성 연구와 응용에 대한 연구이다. 우선, 우리는 액체상태에서 금속 나노 입자 유무에 따른 양자점 PL 소거 효과 메커니즘에 대한 체계적인 광특성 연구를 하였다. 아민 작용기가 코팅된 CdSe/ZnS core/shell 양자점과 구연산염 (citrate) 이온이 코팅된 금 나노 입자는 서로 전자기력에 의해 상호작용을 하게 된다. PL, PL exciation, 시분해 PL 분석을 통해 양자점 PL 소거 메커니즘이 금 나노 입자의 존재에 따른 FRET 및 표면 플라즈몬의 향상 과정에서 영향을 받은 것을 확인하였다. PL 소거 현상은 FRET 과 표면 플라즈몬의 향상 효과의 복합 작용의 결과로 볼 수 있는데 PL 세기 감소의 중요한 요소가 무엇인지를 밝히기 위해 다양한 가능성을 고려하여 체계적인 분석을 하였다. 1) 다양한 양자점 크기와 여기 에너지를 변화에 따른 효과를 보기 위해서 양자점 크기를 변화 시켜가며 PL 특성을 관찰하였고; 2) 금 나노 입자의 존재는 여기광을 산란시켜 양자점 여기에 영향을 줄 수 있고 양자점 PL을 일부 흡수할 수 있기 때문에 이와 관련된 inner filter 효과의 영향을 검토하였다. 3) 양자점과 금 나노 입자 사이의 정전기 상호작용에 관한 분석을 위해서sodium chloride 를 더 한 뒤 PL 특성의 다시 원상태로 돌아오는 것을 확인하였는데 그 결과 양자점과 금 나노 입자의 상호작용이 PL 소거 효과와 크게 관련 되어 있음을 확인하였다.
PL 세기의 향상과 소거 과정에 대한 기초연구를 바탕으로, 우리는 실제 단백질 칩 측정을 위해서 높은 측정 감도와 낮은 검출 한계 (LOD)를 가진 반도체-금속 나노 복합체 기반의 표면 플라스몬 공명 (SPR)과 표면 플라스몬 결합 방출 (SPCE) 측정 방법을 설계하였다. 이를 통해 우리는 최초로 양자점 기반의 전립선 (PSA) 암 단백질 바이오 칩을 SPCE 방법으로 측정하였다. 이를 위하여 5 nm 의 SiO2와 50 nm 의 금 필름이 코팅된 BK7 유리를 기판으로 사용하였으며 PSA 항체 와 결합되어 있는 pegylated 양자점을 사용하였다. 이를 통해 위 시스템의 검출 한계LOD는 10 fg/mL (0.3 fM) 정도로 계산 되였고 기존의 유기 염료를 사용한 연구 결과 (34 fM) 와 비교할 때 약 100 배 정도 높았다. 이와 같은 고감도 측정의 핵심포인트는 양자점의 탁월한 밝기이다. 양자점의 밝기는 일반적으로 사용되는 유기 염료보다 20-40 배 이상이며 양자점의 높은 밝기는 형광 라벨의 수량의 감소에 도움이 되고 또한 비특이성 바인딩을 제한할 수 있다. 또한 이러한 단백질 칩을 SPR 기술을 사용하여 표면 플라스몬 공명 분산곡선의 이미지와 스펙트럼을 측정 한 결과, SPR 시스템을 사용 시100 fg/mL 와 같은 미량의 PSA를 검출할 수 있었다.
위 실험에서 SPCE 와 SPR 측정을 통해 높은 감도와 낮은 검출한계를 동시에 얻을 수 있음을 확인하였다. 이러한 결과는 양자점 라벨링을 통해 인체에 존재하는 미량의 다양한 암 단백질을 검출할 수 있는 고성능 바이오 칩 제작 가능성을 보여주었다. 현재 계속해서 금 나노 입자를 이용한 SPCE 측정을 통해 양자점 기반의 단백질 칩의 측정 감도를 더욱 증가시키고 있다.
