Single-nucleotide polymorphisms (SNPs) are single DNA sequence variations in specific site of genomic DNAs obtained from different individuals. The SNPs are the most common type of genetic variation among people. Humans have approximately one SNP per 1000 base pairs on average which causes individual difference in physical or physiological features. Besides, they can serve as biological signposts for genes associated with genetic disease, helping predict an individual’s genetic predisposition to disease.
In this study, a novel multiplex mutation genotyping method was developed utilizing ligase reaction and nicking amplification based on mass spectrometry. To identify a mutated base in specific site, ligase reaction was performed using two ligation probes that flanked the mutation site. The primary ligation probe is designed to contain both a complementary base to that of mutation site at its 5′ end and a primer annealing site for nicking amplification at the 3’ end. The secondary probe is designed to have a nicking enzyme recognition site and a mass marker sequences at its 5’ end. Therefore, the primary and secondary ligation probes were linked only in the presence of mutant alleles in DNA sample. The ligation product was then utilized as a template for nicking amplification reaction. The universal primer was annealed to the 3’ end of the ligation product and extended during the nicking amplification reaction. As a result of the reaction, the cleaved short DNA segments used as a mass marker were generated and amplified. They were subjected to MALDI-TOF MS (Matrix Assisted Laser Desorption/Ionization - Time of Flight Mass Spectrometry) and the mass peak was detected only in the case of mutant samples. Using this strategy, we successfully identified 4 mutation sites in BRCA 1 gene in a single reaction tube.
This new mass spectrometry-based strategy does not require thermal cycling due to isothermal nicking amplification of mass marker, resulting in rapid analysis of genetic variations. Furthermore, the system has high potentials for high-throughput SNP screening since a variety of mass marker can be designed depending on the mutation sites. Therefore, our method is rapid, sensitive, specific, and cost-effective to identify SNPs, which would greatly benefit the recognition of genetic disorders, drug discovery, pharmacogenetics and prognostics.
단일염기다형성 (Single-nucleotide polymorphism, SNP) 은 각개의 유전자 내에 존재하는 특정 위치의 단일 DNA 염기서열의 차이를 의미하며, 사람의 경우에는 약 1,000 개의 염기서열당 1 개 정도 단일염기다형성이 존재한다. 이는 인종부터 개인의 성격까지 유전적인 개인차를 나타내는 원인이 된다. 단일염기다형성은 사람의 다양한 질환에 많은 관련이 있으며, 특히 유전적 질병과 밀접한 관련이 있다.
본 연구에서는 단일염기다형성의 다중 분석을 위하여 리가제 반응으로 돌연변이 염기서열에 특이적인 리가제 반응 프로브 산물을 얻은 후, 이를 절단효소 증폭반응을 이용하여 질량분석이 용이한 작은 DNA 조각으로 증폭 생성하여 이를 질량분석하였다. 우선 돌연변이 위치와 상보적인 리가제 반응 프로브 쌍을 이용하여 리가제 반응을 수행하였다. 제 1 리가제 반응 프로브는 5’ 말단에 돌연변이 위치의 염기와 상보적인 염기를 포함하며, 3’ 말단에는 절단효소 증폭반응을 위한 프라이머가 혼성화할 수 있는 염기서열이 추가로 포함되어있다. 제 2 리가제 반응 프로브는 5’ 말단에 절단효소 인식 염기서열과 절단효소 증폭반응의 산물이 될 작은 DNA 조각 염기서열이 포함되어있다. 따라서 돌연변이가 있을 경우에만 리가제에 의하여 두 리가제 반응 프로브가 연결된다. 리가제 반응의 산물은 절단효소 증폭반응의 주형으로 사용된다. 리가제 반응 산물에 절단효소 증폭반응을 위한 프라이머가 결합하고, DNA 중합효소에 의해 프라이머가 연장된다. 리가제 프로브가 연결된 경우에는 절단효소 인식부위가 형성되어 절단효소에 의해 작은 DNA 조각이 떨어져 나오게 된다. 이 작은 DNA 조각은 절단효소 증폭반응에 의해 증폭되며, 이 조각은 질량분석을 위한 마커가 된다. 따라서 돌연변이의 경우에만 작은 DNA 조각이 만들어지며, MALDI-TOF MS 분석에서 질량 분석 피크가 돌연변이의 경우에만 나오게 된다. 이 방법을 이용하여 BRCA 1 유전자를 대상으로 총 4 종의 돌연변이 위치를 한 반응 튜브에서 진단하는데 성공하였다.
본 방법에 따른 표적 유전자의 돌연변이 검출방법은 임의의 짧은 길이의 DNA 조각을 대량 합성하여 질량분석하기 때문에 민감도 및 특이도가 우수할 뿐만 아니라 작은 DNA 조각의 길이는 임의적으로 조절할 수 있어 돌연변이의 다중 분석에 유용하게 사용될 수 있다. 따라서 다수의 시료를 대상으로 표적 유전자의 여러 개의 돌연변이 여부를 동시에 신속 정확하게 분석할 수 있어 유전적 요인에 의한 질병의 예방, 조기 진단 및 개인 맞춤 의약품 개발과 처방뿐만 아니라, 현장진단을 위한 바이오센서의 플랫폼으로 유용하다.
