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Synthesis of organic/inorganic hybrid nanomaterials for optical biosensors and cell-free protein expression system = 유/무기 하이브리드 나노소재의 광학 바이오센서 및 무세포 단백질 발현 시스템 응용 연구
서명 / 저자 Synthesis of organic/inorganic hybrid nanomaterials for optical biosensors and cell-free protein expression system = 유/무기 하이브리드 나노소재의 광학 바이오센서 및 무세포 단백질 발현 시스템 응용 연구 / Seong-Yoon Lim.
저자명 Lim, Seong-Yoon ; 임성윤
발행사항 [대전 : 한국과학기술원, 2012].
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Nanomaterials have proven their synergetic utilities in association with biological molecules, such as proteins or nucleic acids, which possess highly specific recognition or catalytic properties. Because of their unique optical, electronic, and catalytic properties, nanomaterials were applied to the development of biosensors for the detection of disease-related proteins that are critical in clinical diagnosis. For instance, gold nanoparticles (Au NPs) have been widely utilized in the assay of various biological events because of plasmonic absorbance that is dependent on their size, versatile electrical properties, and biocompatibility. In this thesis, in situ growth of Au NPs was performed in an alginate gel matrix co-encapsulating Au NP seeds and glucose oxidase (GOx) and coupled with fluorescence quenching for the development of optical biosensor platforms. And graphene oxide (GO)-based immunosensing system for the detection of interleukin 5 (IL-5) through the quenching of intrinsic GO fluorescence induced by a polymerization of peroxidase substrates was investigated. Moreover, the encapsulation of functional protein synthesis machinery in a silica sol-gel matrix or silica-coated alginate hydrogel beads was studied for the effect of encapsulating substance on the in vitro protein expression machinery. Chapter 2 describes the in situ growth of gold nanoparticles (Au NPs) performed in an alginate gel ma-trix co-encapsulating Au NP seeds and glucose oxidase (GOx) for the development of a glucose-sensing plat-form. We observed a simultaneous growth of Au NPs in the alginate matrix through the reduction of AuCl4- by H2O2 on Au NP seeds. The detection of the glucose level was carried out successfully via the coupling of Au NP enlargement with the oxidation of glucose catalyzed by the immobilized GOx. The enlargement of Au NPs in the alginate matrix exhibited only a red-shift in absorbance maxima, while the generation of small Au NPs in a free solution caused a blue-shift in higher glucose concentrations. This study shows that the co-encapsulation of metal NPs and bioreceptor in a gel matrix may provide a simple route for the fabrication of an optical biosensor. Chapter 3 deals with a versatile and facile route for highly sensitive detection of analytes through cou-pling the enlargement of gold nanoparticles with fluorescence quenching. The fluorescence intensity of dye molecules (e.g., fluorescein or rhodamine B) significantly decreased with the increasing concentration of re-ducing agents, such as hydrogen peroxide and hydroquinone. The sensitivity for the detection of reducing agents was much higher than other methods based on the absorbance measurement of enlarged gold nanoparticles or quantum dot-enzyme hybridization. We could successfully detect acetylthiocholine with the detection limit of several nM orders using an enzymatic reaction by acetylcholine esterase, a key route for the detection of toxic organophosphate compounds. The fluorescence quenching approach described in this report requires only a simple addition of fluorescence dye to the reaction solution without any chemical modification. The strategy of fluorescence quenching coupled with nanoparticle growth would provide a new horizon for the development of highly sensitive optical biosensors. In Chapter 4, Fluorescent dye-doped silica nanoparticles (FSN) with gold nanoparticle (Au NP) seeds are synthesized for a fluorescence-based solid-phase detection of target chemicals based on the growth of Au NPs. FSN-Au NP probe was successfully applied to the detection of H2O2, hydroquinone, glucose, acetylthi-ocholine, and neurotoxin by employing glucose oxidase and acetylcholine esterase. The stacks of FSN-Au NP probes on glass were demonstrated as a sensing platform for the glucose detection to test the usability of the probes on a dry substrate. The FSN-Au NP probes may provide simple and multi-purpose probes for optical biosensors. In Chapter 5, an immuno-biosensor based on the fluorescence quenching of graphene oxide (GO) by the peroxidase-catalyzed polymerization of 3,3’-diaminobenzidine (DAB) is developed for the detection of IL-5. Anti-IL-5 antibodies were immobilized on GO which is deposited on amine-modified glass surface. IL-5 and horseradish peroxidase (HRP)-linked antibodies conjugates were consequently introduced to form the sandwich immunocomplex on GO. DAB were then polymerized by HRP-catalyzed oxidation in the presence of H2O2, resulting in the decrease of fluorescence of GO. This immunoassay system exhibited high specificity for IL-5 among other cytokines. The GO-based immuno-biosensor system was investigated with UV/Vis, fluorescence and Raman spectroscopies and AFM analysis. Chapter 6 describes the encapsulation of functional protein synthesis machinery in a silica sol-gel matrix. When the sol-gel reaction using alkoxysilane monomers was carried out in the presence of Esche-richia coli cell extract, macromolecular protein synthesis machinery in the cell extract was successfully im-mobilized within a silica gel matrix, catalyzing the translation of co-immobilized DNA when supplied with small-molecular-weight substrates for protein synthesis. The efficiency of protein synthesis was affected by the pore size of the gel structure, which was controlled through the use of appropriate additives during the sol-gel reactions. To the best of our knowledge, this is the first report describing the reproduction of the entire set of complicated biological process within an inorganic gel matrix, and we expect that the developed technology will find many applications in numerous fields such as high-throughput gene expression and the development of multifunctional biosensors. Lastly, in Chapter 7, silica-coated alginate beads successfully encapsulate transcriptional and trans-lational machinery for the prolonged cell-free synthesis of functional protein. The silica coating, identified by optical microscope and energy dispersive spectroscopy, made the beads more resistant - than bare or chi-tosan-coated beads - to an alginate-dissolving environment. The permeation of small molecules through the silica coat was confirmed by the efficient intake of small fluorescent molecules. Macromolecules such as enhanced green fluorescent protein (EGFP) and fluorescence-labeled antibody were retained much longer in the silica-coated beads than in other beads. These characteristics of silica-coated beads have found utility in cell-free protein synthesis, which was verified by the successful synthesis of EGFP in the beads including DNAs and protein synthesis machinery. The productivity of the target protein increased by two-fold in the silica-coated beads over the bare alginate beads, and the activity of the protein synthesis machinery was elongated by five-fold and three-fold over bare and chitosan-coated beads, respectively. The individual pro-tein synthesis units of silica-coated alginate beads can be utilized for the parallel synthesis of diverse func-tional proteins in designed combinations, which may lead to the development of artificial cells in the future.

나노소재와 생체분자의 융합을 통한 나노바이오 분야가 최근 각광 받고 있는데 이는 생체 분자가 갖는 우수한 인지능력 (molecular recognition) 및 촉매작용(catalytic acitivity)을 유지함과 동시에 나노소재가 가진 특이한 물리, 화학적 성질을 융합하여 질병진단, 환경공학, 에너지 등 현대 사회가 직면한 문제에 대한 해결책을 제시할 가능성을 가지고 있기 때문이다. 예를 들어 금 나노입자의 경우 크기에 따른 흡광도 변화, 다양한 물리, 화학, 전기적인 특성 그리고 생체적합성으로 인해 다양한 생물학적 현상에 적용된 바가 있다. 본 논문에서는 금 나노입자의 성장을 이용한 바이오센서 소재를 연구하기 위해 이를 알지네이트 하이드로젤 비드 내에 적용하였으며, 형광 분자와의 상호작용을 연구하였다. 그리고 그라핀 옥사이드 (graphene oxide, GO) 기반의 항원-항체 바이오센서 개발에 대한 연구를 기술하였으며, 마지막 부분에서는 무세포 단백질 합성 시스템을 실리카 솔-젤 매트릭스 또는 실리카가 코팅된 칼슘 알지네이트 비드에 담지하여 단백질 발현 시스템에 대한 효과를 재료과학적 관점에서 연구하였다. 제2장부터 제4장에서는 금 나노입자의 성장을 이용한 바이오센서 플랫폼용 소재에 대한 연구를 기술하였다. 제2장에서는 기존에 보고된 금 나노입자가 염화금 이온 및 금 이온 환원제의 존재하에 성장하는 금 나노입자의 성장반응을 칼슘 알지네이트 비드내에서 일어나게 하여, 유/무기 하이브리드 하이드로젤 기반의 바이오센서 포맷을 개발하였다. 이 연구에서는 직경 10 nm 정도의 금 나노입자를 칼슘 알지네이트 하이드로젤 내에 고정화하여 금 이온과 과산화수소를 첨가한 후 반응시켜 금 나노입자의 성장을 확인하였다. 그리고 이를 응용하여 글루코오스 산화 효소를 금 나노입자와 동시에 알지네이트 비드에 담지하여 글루코오스를 측정하였다. 금 나노입자가 알지내이트 비드 내에서 성장하면 비드가 붉은 색으로 변하고 이에 따라 520~530 nm 범위의 흡광도가 증가하게 되므로 이를 통해 목표 분자의 농도를 측정하는 효소반응 기반의 바이오센서 플랫폼을 개발할 수 있었다. 제3장에서는 금 나노입자의 성장을 형광을 통해 검출 할 수 있는 연구를 목표로 진행하였다. 기존의 금 나노입자 성장을 통한 목표 분자의 검출은 금 나노입자의 성장에 의한 흡광도 증가를 측정하였으나, 본 논문에서는 금 나노입자의 흡광 영역과 중첩되는 파장영역에서 형광을 갖는 형광분자를 혼합하였을 때 금 나노성장에 의한 형광 저하를 이용하였다. Fluorescein분자의 경우 520 nm를 중심으로 형광 발광을 갖는데, 금 나노입자가 성장하는 정도에 따라 fluorescein의 형광이 감소하였다. 이 현상은 540 nm에서 형광을 발산하는 rhodamine B의 경우에서도 동일하게 나타났다. 이 현상을 이용하여 용액상태에서 과산화수소 및 하이드로퀴논과 같은 금 나노입자의 환원제를 검출할 수 있었다. 그리고 글루코오스 산화효소, 아세틸콜린 에스터화 효소를 첨가한 경우, 해당 효소와 기질의 반응 생성물에 의해 금 나노입자가 성장하는 것을 fluorescein의 형광이 감소하는 것을 통하여 acetylthiocholine 및 글루코오스를 측정할 수 있었다. 제 4장에서는 3장의 연구 결과를 이용하여 고체 기질 상에서 금 나노입자의 성장에 의한 형광 저하 반응이 일어나는 바이오센서 플랫폼 연구를 진행하였다. 용액상의 바이오센서보다 고체상 바이오센서가 사용자에게 편리하기 때문에 용액상에서 반응을 했던 물질들을 나노입자 상에 고정화 하였다. 본 연구에서는 우선 FITC (fluorescein isothiocyanate)가 도핑된 형광 실리카 나노입자를 제조하여 이 나노입자 상에 약 2.5~4 nm 직경의 금 나노입자를 도포시켜 바이오센서용 프로브를 제조하였다. 이 프로브를 금 이온과 환원제가 있는 용액에 첨가하면 형광 실리카 나노입자상의 금 나노입자가 성장하게 되며 이에 따라 형광이 저하되었다. 이를 TEM, fluorophotometer 를 통하여 확인하였고, 과산화수소, 하이드로퀴논 외에 효소를 이용하여 글루코오스 및 acetylthiocholine을 민감하게 측정할 수 있었다. 또한 본 연구의 금 나노입자-형광 실리카 나노입자 프로브를 유리 표면에 적층시킬 수 있었는데 이를 글루코오스 측정에 이용하였다. 이 적층된 프로브로 실험한 결과를 통해 본 연구에서 제시된 프로브가 실제로 고체 표면에 고정화된 상태에서도 반응하여 목표 분자를 측정하는데 사용될 수 있다는 것을 확인하였다. 제5장에서는 기존의 효소-바이오센서에서 벗어나 항원-항체 반을 이용한 나노소재 기반의 바이오센서 연구를 진행하였다. 본 연구에서는 GO의 내재적 형광이 저하되는 것을 측정하여 IL-5를 검출할 수 있는 바이오센서를 개발하였다. GO는 음전하를 띄기 때문에 아민 처리된 유리 표면에 쉽게 결합하게 되는데, 유리 표면에 결합한 GO상에 항IL-5 항체를 고정화 한 후 IL-5 항원 및 미리 준비된 항 IL-5항체-HRP 결합체를 반응시켜 GO상에서 Immune-complex를 만든다. 이후 HRP의 기질인 diaminobenzidine (DAB)을 첨가하면 HRP가 고분자화되면서 GO상에 붙으며 결과적으로 GO의 형광을 저하시킨다. 이를 통해 IL-5가 첨가된 phosphate buffered saline (PBS) 및 human serum에서 IL-5농도별로 측정하였으며 검출한도는 PBS 내에서는 5 pg/ml 이었고 human serum을 사용한 경우 10 pg/ml를 기록하였다. 제 6장과 제7장의 연구는 무세포 단백질 발현 (cell-free protein synthesis, CFPS) 시스템을 유/무기 혼합소재 기반의 매트릭스에 담지하여 목표 단백질의 생산에 미치는 영향을 연구하였다. 제 6장에서는 다공성 실리카 솔-젤 기반 매트릭스내에 CFPS machinery 를 담지하여 목표 단백질인 GFP (green fluorescence protein)를 발현시켰다. 이 연구에서는 순수한 실리카 솔-젤 매트릭스 외에 솔-젤 공정 중에 첨가제로 PVA, 알지네이트, PEG를 사용하였으며, SEM등으로 제조된 매트릭스를 분석한 결과 PEG가 첨가된 솔-젤 매트릭스가 적당한 다공성 구조를 지니고 있었으며, 가장 우수한 단백질 발현을 보였다. 마지막으로, 제7장에서는 실리카로 코팅된 알지네이트 하이드로젤 비드에 CFPS machinery를 담지하여 실리카 코팅이 단백질의 발현량에 미치는 영향을 연구하였다. 단순 알지네이트 하이드로젤 비드와 달리 실리카로 코팅된 비드의 경우 온도, 산도 변화에 저항성이 높은 특성을 보였으며 실제 목표 단백질 발현 실험에서도 오랫동안 더 많은 GFP를 생성시키는 결과를 나타냈다. 결론적으로 본 논문에서는 바이오센서 기반 소재 및 다중 생체분자 담지용 소재 연구를 통해 나노바이오 하이브리드 소재가 가진 가능성을 살펴보았다. 금 나노입자, 형광분자가 도핑된 실리카 나노입자, 그라핀 옥사이드 등 본 논문에서 다루어진 몇 가지 나노소재 만을 사용하면서 흥미로운 결과를 관찰할 수 있었다. 이러한 맥락에서 볼 때, 현재 존재하는 금속, 세라믹, 유기분자 기반의 다양한 나노소재와 효소, 항체, DNA, 세포 등 생체분자의 융합은 새로운 물성을 지닌 하이브리드 소재를 개발하는데 무한한 가능성이 있으며, 이를 위해 다양한 기반연구가 필요할 것으로 판단된다. 이에 본 논문에 기술된 연구 결과들이 향후 우수한 물성을 지닌 나노-바이오 신소재의 합성, 설계에 기여할 것으로 기대된다.

서지기타정보

서지기타정보
청구기호 {DMS 12039
형태사항 x, 98 p. : 삽도 ; 30 cm
언어 영어
일반주기 저자명의 한글표기 : 임성윤
지도교수의 영문표기 : Chan-Beum Park
지도교수의 한글표기 : 박찬범
수록잡지명 : "Multi-layered Stacks of Fluorescent Dye-Doped Silica Nanoparticles Decorated by Gold Nanoparticles for Solid-Phase Optical Biosensing". Journal of Materials Chemistry, 21, 17623-17626(2011)
수록잡지명 : "Gold Nanoparticle Enlargement Coupled with Fluorescence Quenching for Highly Sensitive Detection of Analytes". Langmuir, 25, 13302-13305(2009)
학위논문 학위논문(박사) - 한국과학기술원 : 신소재공학과,
서지주기 References : p. 87-98
주제 biosensor
cell-free protein expression
nanomaterials
바이오센서
무세포 단백질 발현
나노소재
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