Highly fluorescent dyes or nucleotide base analogs can serve as extremely sensitive probes in nucleic acid systems and enable experiments to be measured in solution, with real-time kinetic resolution. Two crucial properties of such compounds are their ability to form specific base pairs with the natural bases and to have a sufficient fluorescence quantum yield also when incorporated into oligonucleotides. Using this property it was widely used in the studying of conformational change of nucleic acid structure. Such fluorescence techniques are finding widespread application in biochemical and biophysical studies of macromolecules, as well as in medicinal, environmental and commercial research efforts. In studies of nucleic acids, fluorescence spectroscopy provides an important tool for the detection and probing of structure, dynamics and interactions. Based on the unique properties of fluorescent base analog, we developed novel real-time PCR methods, fluorescent aptasensor, and fluorescent molecular beacon sensor for gene quantification and small molecule, protein, and metal ion detection.
In the first topic, novel real-time quantitative PCR (qPCR) methods were developed by using fluorescent nucleotide base analogs. Because the quantum yield of the fluorescent base depends on hybridization with complementary sequences, the fluorescence intensity of the fluorescent base in single-stranded DNA (ssDNA) will be different from that of the fluorescent base in double strand. Based on these properties, two conceptually different real-time PCR approaches are presented: the first involves the fluorescence signal decreasing while the second involves the fluorescence signal increasing. The former strategy is based on the fluorescent base incorporated into reverse primers. As the reverse primer hybridized to the template DNA, the fluorescence signal was gradually quenched after every annealing step, because the fluorescent bases presented in the double-stranded DNA. The latter strategy was based on universal fluorescent probes (20 bases) complementary to extended probes (universal template primer: 20 bases) of forward primers (total 42 bases). At the first cycle, the universal template forward primer hybridized to the template DNA and was extended. From the second cycles, as the reverse primer were extended using the extended forward primer as template to the end of 5’-universal template primer, the fluorescent base probes were hydrolyzed or displaced by DNA polymerases, and resulted in signal generation. These real-time methods could be a new era for real-time qPCR. Our results suggest that these fluorescent base probes are simple, efficient, significant and reliable for real-time qPCR method.
Furthermore, novel fluorescent aptasensors, based on unmodified target specific aptamers and the fluorescent nucleotide analog, pyrrolo-dC (PdC), have been developed for molecular recognition of targets. In the new aptasensors, binding of a target molecule to a corresponding aptamer sequence triggers dehybridization of a signaling probe containing the PdCs along with its concurrent transformation from a non-fluorescent double-stranded form to a free fluorescent state. In a first approach to designing novel aptasensors, individual, target selective signaling probes that contain three PdC bases serve as competitors through hybridization with the aptamer sequence. Upon binding of the target molecule, the competitors dissociate from the aptamer and, in their free state, produce fluorescence signals. A more advanced strategy was also developed that employs a single universal signaling probe for detection of different target molecules. In this approach, the loop and one stem part of the competitor sequence is designed to hybridize with the respective target aptamer and the signaling probe, forming triplex DNA in the absence of the target molecules. In the presence of the target molecules, the competitor dissociates from the aptamer owing to the interaction between the aptamer and target molecule and, as a result, an intrinsic hairpin structure is generated that causes separation of the signaling probe from the stem part. Fluorescence of the released signaling probe indicates the presence of target analytes. Aptasensors, designed by using this strategy, have been employed to detect various substances, including ATP, thrombin, and platelet-derived growth factor (PDGF).
Finally, a novel and simple DNA molecular beacon (MB)-based sensor with fluorescent base analog for mercury ion sensing was presented. This method is based on the Hg2+-induced conformational change of a T-rich MB and followed by fluorescent signal change of the fluorescent base, pyrrolo-dC (PdC). The MB contains a T-rich 26-mer loop and a stem of a pair of five bases including PdC. In the presence of mercury ion, the loop part of MB hybridize with its another loop part of MB to form double strand DNA (dsDNA) and release the stem part be free to generate fluorescence signal. To reduce background signal, five cytosine bases were designed to the loop part of MB. Furthermore, the signal was increased with 5 guanine bases in the presence of the mercury ion. This formation of dsDNA reduces the quenching phenomena of PdC in the MB structure, but increases the fluorescence signal. With the optimum conditions described, the system exhibits a dynamic response range for Hg2+ from 1.0?0-12 M to 5.0?0-7 M with a detection limit of 5.0?0-12 M. This fluorescent MB sensor showed very high sensitivity and specificity.
To the best our knowledge, it was the first approach to develop the fluorescent base-real time PCR method. Moreover, the fluorescent aptasensor and the fluorescent molecular beacon sensor were successively used to detect small molecule, proteins, and metal ions. The findings here suggest that the fluorescent base analogs would be a good candidate of fluorescent materials, a substitute for natural bases, and would be applied to DNA based biosensor and diagnosis.
강한 형광세기를 갖고 있는 뉴클레오티드 염기 유사물들은 핵산 시스템에서 매우 민감한 probe로 사용되고 있으며 또한 용액상에서도 측정이 용이한 특징을 이용하여 실시간으로 그 kinetic resolution을 측정할 수 있다. 두가지 결정적인 특성이 있는데, 이는 바로 자연계의 염기들과 특정 염기쌍을 이룰 수 있다는 것과 핵산 올리고뉴클레오티드에 단일가닥과 이중가닥으로 존재할 때 양자수율에 변화가 생긴다는 특성을 갖고 있다. 형광염기의 이러한 특성을 이용하여 핵산의 구조변화를 연구하는데 많이 사용되고 있다. 또한 형광의 특성을 이용하여 생화학적이고 생물물리학적인 연구에 많이 응용되고 있으며, 더 나아가 약학, 환경, 통상연구에도 많이 응용되고 있다. 핵산의 연구에 있어서 형광 분광기는 구조, 역학, 및 상호작용을 연구하는데 있어서 아주 중요한 수단으로 되고 있다.
이 졸업논문의 첫번째 주제는 바로 이러한 형광염기들의 특성을 이용하여 새로운 real-time PCR 방법들을 개발한 것이다. 형광염기들의 양자수율은 상보적인 염기서열과 혼성화여부에 결정되기 때문에, 단일가닥 핵산에 존재하는 형광염기의 형광세기는 이중가닥 핵산에 존재할 때와 엄연히 그 세기차이가 난다. 이러한 특성을 이용하여 두 가지 완전 다른 형식의 real-time PCR 방법들이 개발되었다. 첫번째 방법에서는 PCR이 진행됨에 따라 형광세기가 점점 줄어드는 것이고, 두번째 방법에서는 그와 반대로 PCR이 진행됨에 따라 형광세기가 점점 증가하는 것이다. 구체적으로 다시 말하면, 첫번째 방법에서는 형광염기가 함유된 역방향 프라이머를 이용한 것으로, 역방향 프라이머가 주형 DNA에 혼성화되면 형광 시그널이 매 결합단계에서 점점 감소하게 되는데, 이는 형광염기가 DNA의 단일가닥에 존재하는 비율이 줄어들고 이중가닥에 존재하는 비율이 증가하기 때문이다. 두번째 방법에서는 20개의 염기를 함유한 universal 형광 탐침이 42개 염기를 함유한 정방향 프라이머 중 20개의 universal 염기서열에 상보적인 구조를 갖는 특이한 프라이머를 디자인하고 이용한 것이다. 이 방법에서는 첫번째 순환에서 universal 주형 정방향 프라이머가 주형 DNA에 혼성화되어 연장된다. 두번째 순환부터 역방향 프라이머가 첫번째 순환에서 형성된, universal 주형 정방향 프라이머가 포함된 주형 DNA에 혼성화되어 연장함으로써 5’ 끝에 결합되어 있던 universal 형광염기 탐침을 DNA 중합효소에 의해 치환시키거나 가수분해하여, 형광염기가 DNA 이중가닥으로부터 단일가닥 혹은 모노머로 됨으로써 형광 시그널을 내는 것이다. 이러한 real-time PCR 방법들의 형광염기 탐침들은 간편하고, 효율적이고, 주목할 만하며, 믿을만한 PCR 방법으로 현재 real-time PCR 영역에서 새로운 장을 열어줄 것이다.
또한 형광염기 유사물인 pyrrolo-dC (PdC)의 형광세기를 갖는 특성을 이용하여 목적 분자들을 검출하는 새로운 형광 압타센서를 개발하였다. 이 새로운 압타센서에서는 압타머들이 목적 분자들과 결합하였을 때, PdC를 함유하고 있는 시그널링 탐침이 형광이 상대적으로 소멸된 이중가닥 DNA로부터 분리되어 형광을 띄는 단일가닥으로 되는 현상을 이용하였다. 이러한 개념의 압타센서를 개발하기 위하여 두가지 방법이 도입되었다. 첫번째 압타센서는 목적 분자들을 인식하는 압타머와 PdC를 함유하고 있어 시그널을 형성하는 경쟁 DNA로 구성되었고, 경쟁 DNA는 압타머의 부분 서열과 서로 상보적이다. 일단 압타머가 목적 분자와 결합하게 되면, 경쟁 DNA는 압타머로부터 분리되어 형광시그널을 나타내게 되는 것이다. 더 개선된 압타센서로는 똑같은 universal 시그널링 탐침을 이용하여 서로 다른 목적 분자들을 검출하는 것이다. 이 압타센서는 목적 분자들을 인식하는 압타머, 압타머에 서로 상보적인 경쟁 DNA (competitor: 머리핀 구조를 갖고 있는 이 경쟁 DNA는 고리부분이 압타머에 서로 상보적임), 그리고 universal 서열을 갖고 있는 경쟁 DNA의 stem의 한 부분에 서로 상보적인 서열을 갖고 있는 universal 형광염기 탐침 (UFB probe), 이렇게 세가지 올리고뉴클레오티드로 구성되었다. 목적 분자들이 존재하지 않을 때, 이 세 올리고뉴클레오티드는 aptamer/competitor/UFB probe 삼중합체를 이룬다. 하지만, 목적 분자들이 존재할 경우, competitor는 aptamer로부터 해리되면서 머리핀 구조모양을 이루게 되고, 이로 인해 UFB 탐침도 competitor로부터 분리되면서 이 형광염기의 고유의 형광시그널을 나타내게 된다. 개선된 압타센서의 제일 큰 장점은 똑같은 UFB 탐침으로 서로 다른 여러가지 목적 분자들을 검출할 수 있다는 것이다. 그리하여 비용면에서도 많이 절감할 수 있는 장점도 갖고 있다. 이러한 압타센서들을 이용하여 ATP, thrombin, PDGF (platelet-derived growth factor)과 같은 목적 분자들을 검출하였으며, 이 두 시스템 모두 높은 민감도와 선택성을 보여주었다.
마지막으로, 형광염기 유사물의 특성을 이용하여 새로운 형광 molecular beacon (MB) 센서를 개발함으로써 금속이온 즉 수은 이온을 검출하는 시스템을 구축하였다. 이 방법은 수은 이온으로 인한 티민이 풍부한 MB의 구조변화와, 이와 동시에 일어나는 형광염기 유사물인 PdC의 형광세기의 변화를 이용한 것이다. 이 MB DNA는 티민이 풍부한 26개 염기를 갖고 있는 loop 부분과 PdC를 함유하고 있는 5개 염기쌍을 갖는 stem 부분으로 구성되었다. 수은이온이 존재하지 않을 때, 이 MB DNA는 머리핀 구조를 유지함으로써, 형광염기가 이중가닥에 위치하게 되는데, 이때 형광세기는 많이 감소되어 있다. 반대로, 수은이온이 존재할 경우, MB DNA는 티민이 풍부한 loop 부분들이 서로 상보적으로 T-Hg2+-T 서열 구조를 형성하기 때문에, stem 부분들이 dehybridization 됨으로써, PdC는 자유로운 단일가닥에 존재하게 되는데, 이때 형광시그널은 상대적으로 증가하게 된다. 또한, 배경 시그널을 줄이기 위하여, MB의 loop부분에 시토신 염기 5개를 함유시켰고, 검출 시에는 수은이온과 함께 구아닌 염기 5개인 올리고뉴클레오티드를 첨가하여 이 시스템의 전반적인 민감도를 증가시켰다. 하여, 이 시스템의 최적화된 실험조건으로 수은 이온을 1.0×10-12 M으로부터 5.0×10-7 M까지 실험을 수행해본 결과, 검출한계(LOD: limit of detection)를 5.0×10-12 M까지 낮출 수 있었다. 또한, 이 시스템을 다른 금속이온으로 테스트해본 결과, 형광시그널의 변화가 거의 없었다. 따라서, 이 형광 MB 센서는 매우 높은 민감도와 선택성을 보여준다는 것을 입증할 수 있었다.
우리가 알고 있는 바에 의하면, 이 논문에서 기술한 여러 시스템들은 처음으로 형광염기를 도입하여 새로운 real-time PCR 방법을 개발하였고 또한 형광압타센서나 형광 MB 센서들을 이용하여 단분자, 단백질을 비롯한 바이오물질 및 금속이온을 매우 성공적으로 검출하였다. 새롭게 개발된 연구들로부터 알 수 있는바, 형광염기 유사물들은 아주 좋은 형광물질들의 대체품으로 이용될 수 있으며 또한 향후 핵산에 기반된 바이오센서와 진단시스템에도 광범위하게 적용될 것이라고 본다.
