Patrinia villosa, a Chinese medicinal herb, is known for its anti-inflammatory effects. In the present study, we tested the pro-angiogenic efficacy of an aqueous extract of Patrinia villosa (PVE) in vitro and in vivo. Treatment with PVE significantly enhanced cell proliferation, migration, and the capillary-like structure forming activity of cultured human umbilical vein endothelial cells (HUVECs). Western blot analysis demonstrated that PVE treatment induced a time-dependent phosphorylation of FAK and Akt in HUVECs. Preincubation with a FAK inhibitor, SC203950, abolished PVE-induced proliferation of HUVECs, indicating a role for FAK in PVE-induced angiogenesis. The proangiogenic activity of PVE was confirmed by an ex vivo mouse aortic ring assay and an in vivo murine hindlimb ischemia model. Further analysis using fractions of PVE partitioned by n-hexane, EtOAc, n-BuOH, and water residue revealed that the EtOAc fraction contains the bioactive components responsible for PVE-induced migration, tube formation, FAK phosphorylation, and aortic ring sprouting. Our results provide a rationale for the use of PVE in the treatment of peripheral vascular insufficiency; they indicate the need to identify the novel pro-angiogenic chemicals in the fractions of PVE.
We observed an in vivo angiogenic effect of PVE by showing that intramuscular administration of PVE (20 ??l of 2.5 g/L) significantly lowered the necrosis probability of ischemic limbs. Even though PVE can be administered orally, we used an intramuscular injection to keep the experimental conditions consistent with those used in the VEGF-treated mice. The dosage of PVE was determined according to the ratio of agent to body weight. Generally, 1??3% of Patrinia villosa in one dose (3.75 g) of traditional decoction is introduced into the human body; therefore, we injected 20 ??l of 2.5 g/L PVE into a mouse that typically weighs 20g. The advantages of PVE for clinical use are its stability and convenience of use, from oral administration like tea to syringe injection like herbal acupuncture.
Our in vivo results are supported by in vitro studies showing that PVE stimulates HUVEC cell proliferation and migration as well as the formation of capillary-like structures that play an essential role in neovascularization. Angiogenesis is a multi-step process involving proliferation and migration of endothelial cells, remodeling of the extracellular matrix, and the formation of capillary tubules. Our results indicate that FAK is implicated in PVE-induced angiogenesis; this is consistent with previous reports.
The proliferative effect of PVE on HUVECs was marginal. It was not as high as expected, partly because the many flavonoids in PVE may function as antioxidant agents and thereby exert an inhibitory effect on angiogenic activity. Some flavonoids such as anthocyanidin inhibit VEGF-induced endothelial cell signaling, and it is possible that the whole angiogenic process is tightly controlled by the reduction/oxidation environment of the cell . Patrinia villosa is known to have an angiogenic effect on HUVECs and a contradictory, antiproliferative effect on cancer cell lines; this may in part be due to the cellular environment and/or the antioxidant effect of the flavonoids. It is likely the many compounds contained in PVE react antagonistically to cause an eventual in vivo vascular biological effect; similarly, other medicinal herbs like ginseng contain both pro-angiogenic and anti-angiogenic compounds.
Collectively, our data provide the first pharmacological evidence that PVE significantly induces angiogenesis in vitro and in vivo. Its effect may be due to an increase in cell proliferation and migration through the activation of the FAK signaling pathway. Although further experiments will be needed to clarify the major proangiogenic compounds in PVE, it should be considered a potential therapeutic drug for ischemia-associated peripheral vascular diseases and wound healing.
신생혈관은 기존 맥관구조로부터 형성되는 새로운 혈관에 의해 엄격히 조절된다. 신생혈관은 상처 치유(wound healing), 생리 복구(menstrual restoration), 조혈작용(hematopoiesis) 및 종양 성장과 같은 넓은 범위의 병리생리학적 과정에 중요한 역할을 한다. 신생혈관 생성 동안, 내피세포는 기저막을 분해하고, 세포간 기질 주위로 이동하여, 새로운 혈관을 생성하기 위하여 증식하며, 근접한 관상의 순(sprout)으로 분화한 다음 곧이어 기능적 모세관 루프를 형성한다. 이러한 세포 현상은 다양한 세포 내 신호전달경로에 의해 매개되며, 이때 국소 부착 키나제(focal adhesion kinase, FAK)가 관여하는 것으로 알려져 있다. FAK는 특히 혈관내피세포의 이동 및 생존에 중요한 역할을 하는 것으로 보고되어 있다. 혈관내피세포에서 FAK의 유실은 시험관 내(in vitro) 관형성(tubulogenesis), 세포 생존, 증식, 및 이동을 감소시키는 반면, 내피세포에서 FAK의 과발현은 허혈에 의해 유도된 신혈관형성(neovascularization)뿐만 아니라 상처에 의해 유도된 혈관신생을 촉진한다.
뚝갈(Patrinia villosa)은 동아시아 및 북미 북동부에서 주로 발견되는 약초로서, 동양의학에서는 수 백 년 전부터 염증, 출산 후 복통 등에 사용되어 왔다. 또한, 한방의료에 있어서, 율무(Coix lachryma-jobi), 부자(Aconitum carmichaeli) 및 뚝갈로 구성된 "의이인부자패장산(薏苡仁附子敗醬散)"이라고 하는 탕약은 급성 충수염의 치료를 위해 수술적 요법이 있을 때까지 거의 유일한 치료제로서 사용되었다. 뚝갈의 정성적 효능은 동의보감, 임원경제지(인제지) 등의 원전 기록에 따르면, 주로 열을 내리고(??熱) 독을 풀고(解毒) 농을 빼며(排膿) 산후 어혈을 빼고(祛瘀) 복통을 치료(治産後腹痛)한다고 한다. 또한, 뚝갈의 항염 효과와 더불어, 뚝갈에 포함된 다양한 화합물은 다양한 암세포주에 대해 항암 효과를 가짐이 보고되었다. 그러나, 아직 뚝갈 추출물 또는 이의 분획물의 생체 내(in vivo) 활성 및 그것의 생물학적 활성에 대한 신호 기작은 보고된 바가 거의 없다.
이에, 본 연구는 높은 치료적 활성과 낮은 부작용을 가지는 천연물 유래의 신생혈관 촉진용 물질을 발굴하고자 하였다. 뚝갈의 수추출물과, 뚝갈 추출물로부터 분리한 분획물(특히 에틸아세테이트 분획물)이 내피세포의 증식 및 이동, 관 구조의 형성 및 내피세포 발아를 촉진시키고, 동물 실험을 통한 생체 내(in vivo) 사지 허혈 모델에서 조직 괴사를 현저하게 감소시킴을 확인하였다. 그리하여 뚝갈 수추출물과 뚝갈 추출물을 헥산, 에틸 아세테이트, 부탄올 등의 유기용매로 분획한 분획물로 실험을 계속한 결과 패장초 분획물 중 에틸 아세테이트 분획물은 매우 우수한 신생혈관 활성능력으로 사지말단의 허혈과 그로 인한 괴사의 예방과 치유, 상처의 회복, 동맥경화증, 심근경색, 협심증, 만성궤양, 화상, 허혈성 뇌졸중, 류마티스 관절염, 건선, 궤양 및 뇌혈관성 치매 등 신생혈관 의존성 질환에 사용될 수 있는 근거를 밝혔다.
