Glycerol has been a by-product from biodiesel industry. Its economical viability and natural potential as a carbon source have motivated engineering of Mannheimia succiniciproducens for the succinic acid production through glycerol fermentation; succinic acid is a dicarboxylic precursor for industrially important chemicals. We describe in silico analysis with genome-scale M. succiniciproducens metabolic model to understand the metabolic flux capacity of fermentative products including succinic acid and undesired biochemical for several carbon sources, and to confirm the effects of glycerol as a suitable carbon source for succinic acid production rationally and systematically. The rate of glycerol utilization in M.succiniciproducens is too slow to directly employ it as an industrial strain. Prior to metabolic engineering of M.succiniciproducens, we performed its metabolic adaptive evolution on glycerol for 50 days to obtain mutant strains in which both cell growth and glycerol utilization were increased. We also proposed several gene overexpression strategies to enhance the utilization rate of glycerol based on the metabolic pathway of the wild type M.succiniciproducens MBEL55E, and conducted wet experiments required to construct a new metabolic pathway of glycerol. Fed-batch fermentations of an enhanced recombinant strain of M.succiniciproducens using glycerol as a carbon source revealed remarkable improved succinic acid productivity. In addition, we achieved homo-production of succinic acid without by-products through the entire fermentation, thus facilitating the purification of succinic acid. Usually, at the final step of fed-batch cultivation, severe inhibition of cell growth has been observed by the accumulation of intracellular succinic acid and redox-imbalance.
In this regard, we performed gene knockout studies of three dicarboxylate transporters selected from genome annotation data, so as to obtain an acid-tolerant strain and elucidate the function of these transporters. Consequently, studies conducted in this thesis would contribute to the cost-effective and environment-friendly production of succinic acid
글리세롤은 글리세린이라고도 불리는 무색 무취의 점성질 액체로, 현재 바이오 디젤 생산과정에서 생산제품의 10분의 1 정도로 부산물이 생산되고 있다. 앞서 살펴보았듯이, 우선적으로 동정한 맨하이마아 숙시니시프로듀센스 MBEL55E 균주의 게놈 정보를 바탕으로 글리세롤을 탄소원으로 가장 효율적으로 이용하고 숙신산 생산을 향상시킬수 있는 공정을 개발하는 데 주력하였다. 실험에 앞서, 맨하이미아 균의 가상세포 모델 프로그램인 MetaFluxNet을 이용하여 시뮬레이션을 전개하여 대사회로를 예측 및 분석하였다. 가상세포 모델의 시뮬레이션 결과, 글리세롤만을 주탄소원으로 이용할 때 glucose 및 sucrose을 사용할 때에 비해 보다 환원성이 높아 부산물인 아세트산,포름산, 피루브산, 젖산, 등 유기산이 많이 줄어들어 100% 호모 숙신산 생산에 효과적임을 예측할 수 있었다. 또한, 맨하이미아의 글리세롤 대사 조절 시스템의 activator 역할을 하는 CRP를 최초로 과발현시켜서 글리세롤 대사를 향상시킬 수 있었으며, 글리세롤 주요 대사프로세스에서 문제가 되는 G3P 축적을 해결하기 위해 클로스트리디움 아세토부틸리컴의 GlpA를 맨하이미아에서 발현시켰고, 이 두가지 효소군을 동시에 적용시킨 재조합 맨하이미아 균주를 통해 최고의 숙신산 생산성으로 숙신산을 성공적으로 생산할 수 있었다. 이와 더불어, 글루코노박터 옥시단스로부터 맨하이미아에 게놈상에 존재하지 않는 제 2의 대사 경로를 도입한 재조합 맨하이미아 균주를 완성하였고, 이 균주의 발효를 통해 글리세롤이 효율적으로 대사하였음을 확인하였다.
우리는 맨하이미아의 유가식 발효 후반부에서 세포성장이 억제되는 현상을 극복하기 위한 방안으로 내성균주를 완성하고자 하였다. 이를 위해, 본 연구에서는 C4-dicarboxylic transporter에 관해 집중적으로 연구를 진행하였다. 맨하이미아 게놈상에 존재하는 DcuB, DcuC, DctPQM의 기능들을 파악하고자, 우선적으로 각 유전자의 결실 실험을 진행하여 야생형 맨하이미아와 비교 분석하였다. 특히, DctPQM 결실 균주에서 야생형 균주에 대비 피루브산의 농도를 상당히 줄일 수 있었고, 최종 숙신산 생산성의 향상을 보여주었다. 또한, 이 균주에 대해 추가적으로 유전자 조작을 수행하여, 아세트산, 포름산 등 다른 부산물들을 줄일 수 있었다. 그렇기 때문에 이 연구는 트랜스포터 정보에 기반하여 대사공학적 기법을 통해 미생물에서 우리가 목적으로 삼는 대사 산물의 단일 생산 공정을 새롭게 개발한다는 점에서 그 의의가 있다.
