The activation of autophagic pathway by alkaline stress was investigated. Various types of mammalian cells were subjected to alkaline stress by incubation in bicarbonate buffered media in humidified air containing atmospheric 0.04% CO2. The induction of autophagy following alkaline stress was evaluated by assessing the conversion of cytosolic LC3-I into lipidated LC3-II, the accumulation of autophagosomes, and the formation of autolysosomes. Colocalization of GFP-LC3 with endolysosomal marker in HeLa GFP-LC3 cells undergoing autophagic process by alkaline stress further demonstrates that autophagosomes triggered by alkaline stress matures into autolysosomes for the lysosome dependent degradation. We found that the inactivation of mTORC1 is important for the pathway leading to the induction of autophagy by alkaline stress since the expression of RhebQ64L, a constitutive activator of mTORC1, downregulates the induction of autophagy after alkaline stress in transfected human 293T cells. These results imply that activation of autophagic pathway following the inactivation of mTORC1 is important cellular events governing alkaline stress-induced cytotoxicity and clinical symptoms associated with alkalosis.
세포 내 pH (cytoplasmic pH, pHi)가 여러 세포 현상에 중요한 요인임에도 불구하고 이에 대한 세포학적 연구는 미진하다. pH의 변화 중 알칼리성 변화는 단백질 folding이나 여러 효소들의 활성에 문제를 일으키고 미토콘드리아에 심각한 손상을 가져오게 되는데, 단백질 folding이나 미토콘드리아의 손상은 자가소화작용을 일으킨다고 알려져 있었다. 이 밖에도 암세포에서는 Glutamine의 deamination을 통한 암모니아를 많이 생성되는데, 이러한 암모니아에 의해 자가소화작용이 일어난다는 보고가 있었다. 위와 같은 현상들을 근거로 하여 알칼리성 스트레스가 자가소화작용을 일으킬 수 있는지 알아보았다.
본 연구에서는 알칼리성 스트레스가 mTOR 신호계와 자가소화작용에 미치는 영향을 알아보았다. 알칼리성 스트레스는 HeLa, 293T, CHO, MCF7, MEF 세포주에서 자가소화작용을 일으키는 것을 확인하였다. 이러한 알칼리성 스트레스에 의한 자가소화작용 중 오포파고좀 포자와 리소솜의 융합이 제대로 이루어지고 있다는 것을 알 수 있었다. 또한, 알칼리성 스트레스에 의해 mTORC1 신호계가 억제된다는 것을 확인 할 수 있었다. mTORC1 신호계는 알칼리성 스트레스에 의한 자가소화작용에 중요한 역할을 한다는 것을 확인 하였다. 알칼리성 스트레스가 어떠한 메커니즘으로 mTORC1 신호계를 저해하는지 알아보기 위해 알아보았으나 그 명확한 메커니즘은 찾을 수 없었다. 알칼리성 스트레스가 AMPK 신호계, Akt 신호계를 통해서 mTORC1 신호계를 저해하지 않는다는 사실은 알 수 있었다. 또한, 알칼리성 스트레스 하에서 mTOR와 Rheb 단백질의 결합에는 변화가 없다는 것도 확인 할 수 있었다. 마지막으로 알칼리성 스트레스에 의해 세포의 성장 (cell growth)이 저해되는 것을 측정하였고, Akt 인산화가 증가하는 것을 확인하였다. 이는 mTORC1 신호계의 하위 타깃들로서 알칼리성 스트레스에 의해 mTORC1 신호계가 억제되고 있다는 간접적인 증거이다. 본 연구를 통해 세포자식작용 조절자로서 알칼리성 스트레스의 역학을 분석 평가할 수 있었으며 mTORC1 신호계의 새로운 조절에 대한 이해를 제공할 것이다.
