Recent genetics and biochemical studies have identified a novel control mechanism of gene expression during amino acid starvation, the so-called ‘stringent response’. The stringent response is triggered by the elevated concentrations of guanosine tetraphosphate (ppGpp), which is synthesized by the RelA ppGpp synthetase in $\it{Escherichia coli}$. Here, we have applied directed evolution techniques to create novel mutant $\it{relA}$ genes with increased ppGpp synthetase activities. Using the constructed mutants, the intracellular concentration of ppGpp in $\it{E. coli}$ cells were increased without amino acid starvation condition. In addition, dramatic changes in gene expression profiles were observed. One hand, the expression of genes involved in translation system was inhibited; on the other, enzymes required for amino acid biosynthesis and transport were activated. And the introduction of the mutant $\it{relA}$ gene into the amino acid producing strains was resulted in increased production of amino acids such as L-threonine, L-lysine, L-phenylalanine, and L-tyrosine. Our results clearly demonstrate that the artificial increase of the intracellular ppGpp by the mutant $\it{relA}$ gene reprogrammed the genome-wide gene expression for the production of amino acids without stringent conditions, and these mutant $\it{relA}$ genes could be applied for the production of amino acids in other bacterial strains.
Furthermore, we showed that the metabolic engineering of the minimized-genome E. coli strain constructed by precise elimination of unnecessary genes or genomic fragment could increase the production of amino acids such as L-threonine, L-lysine, L-phenylalanine, and L-tyrosine. In addition, genome-wide transcriptional profile analysis revealed that the elimination of unnecessary genes have resulted in nutrient and energy saving and an improved substrate yield coefficient, causing more efficient cellular metabolism without physiological compromise. And the introduction of the mutant $\it{relA}$ gene into minimized-genome $\it{E. coli}$ strains further increased the production of amino acids tested. These results and the general applicability of this technique clearly indicate that the mutant relA gene and minimized-genome $\it{E. coli}$ strains are powerful tools for the industrial applications.
아미노산은 생명체의 구성성분인 단백질의 기본 구성단위로, 아미노기와 카르복실기를 포함하는 화합물로서, 조미료 및 감미료, 동물사료, 의약품 및 영양제, 미용 및 화장품, 그리고 펩타이드 합성 등에 이용되고 있어 대량생산이 필수적인 물질이다. 이러한 아미노산의 생산을 위해 미생물 균주를 이용한 아미노산의 생산을 증가시키기 위해 다양한 연구가 진행되었으나 새로운 미생물 유전체를 설계하고 그 기능을 예측하여 아미노산 대량생산에 최적화된 균주를 구축하는 연구는 초보적인 단계에 머물러 있다. Stringent response는 대장균을 포함한 다양한 미생물이 아미노산이 부족한 배지조건에서 균주의 생존을 위해 일으키는 유전체 규모의 유전자 발현조절로서 균주의 성장 속도에 연관되는 rRNA 및 translation에 관련된 유전자들의 발현을 억제하고 아미노산 생산에 관련된 유전자 및 대장균 대사회로에 관련된 유전자의 발현을 증가시켜 아미노산의 생합성을 증가시키는 현상이다.
본연구에서는 이러한 stringent response의 인위적인 조절을 통해 아미노산 생산균주의 유전자 발현을 아미노산의 생산에 최적화시키기 위해 stringent regulator 인 $\it{relA}$ 유전자를 direct evolution 기법을 이용해 ppGpp 생합성 능력이 향상된 새로운 돌연변이 $\it{relA}$ 유전자를 제작하였다. 이렇게 제작된 돌연변이$\it{relA}$ 유전자를 이용해 아미노산이 충분한 조건에서도 대장균내의 ppGpp 농도를 stringent response를 일으킬 수 있도록 증가시켰으며 이를 통해 대장균 유전자 발현을 아미노산의 생합성에 최적화 시켰다. 그 결과 대장균을 이용한 L-threonin, L-lysine, L-phenylalanine, 그리고 L-tyrosine의 생산량을 최소 0.3배, 최대 3배 증가시킬 수 있었다.
또한 대장균 유전체로부터 불필요한 유전자가 제거된 최소유전체 대장균 균주를 이용하여 아미노산의 생산을 더욱 증가시키는 연구를 수행하였다. 대장균 유전체의 14.3%, 23.1%, 26.7%가 제거된 MDS42, MS56, 그리고 MS61 균주를 이용하여 L-threonine의 생산량을 3배 증가시켰다. 대장균 유전자발현 분석 결과 이러한 생산량의 증가는 불필요한 유전자의 제거에 의해 최소유전체 대장균 균주의 대사효율이 증가하였기 때문임을 확인하였다. 또한 최소유전체 균주와 돌연변이 relA 유전자를 함께 이용하여 아미노산의 생산을 극대화 시킬 수 있었다.
이와 같이 최소유전체 균주와 돌연변이 relA 유전자를 이용한 아미노산 생산의 증가는 본 연구에서 확인한 L-threonin, L-lysine, L-phenylalanine, 그리고 L-tyrosine 뿐만이 아닌 다른 아미노산의 생산에도 적용될 수 있으며, stringent response는 대부분의 미생물에서 일어나는 현상이므로 대장균이 아닌 $\it{Corynebacterium glutamicum}$과 같은 균주에서의 아미노산 생산에도 적용될 수 있을 것이다.
