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Helicase CMG and Mph1 involved in two distinct steps of DNA replication = DNA 복제에서 나선효소 CMG와 Mph1의 서로 다른 기능
서명 / 저자 Helicase CMG and Mph1 involved in two distinct steps of DNA replication = DNA 복제에서 나선효소 CMG와 Mph1의 서로 다른 기능 / Young-Hoon Kang.
저자명 Kang, Young-Hoon ; 강영훈
발행사항 [대전 : 한국과학기술원, 2009].
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초록정보

Mcm2-7, ring-structured complex composed of six different subunits, was postulated as a replicative helicase in eukaryotes. Although it doesn’t have helicase activity in vitro, many data indirectly support that it would unwind duplex DNA ahead of replication fork in DNA replication. Recently, the complex containing Cdc45, Mcm2-7 and GINS that has helicase activity was isolated from Drosophila. Based on that report, for the purpose of reconstitution of eukaryotic replication system in vitro, human CMG (Cdc45/Mcm2-7/GINS) complex was isolated in this study. It showed 3’ to 5’ helicase and the ATPase activities. In addition, this helicase activity was stimulated by fork-structured substrate. Mutated versions of CMG complex in putative ATP motif of Mcm subunits showed reduced helicase activity. All these data suggest that CMG complex is universal replicative helicase in eukaryotes. In the course of lagging strand synthesis, the 5’ end of downstream Okazaki fragment is displaced, referred as flap-structure, and cleaved by two structure-specific endonucleases Dna2 and Fen1 to make ligatable nicks. In this study, to find novel factors participate in Okazaki fragment processing, multicopy suppressor screens were performed with Saccharomyces cerevisiae dna2K1080E helicase-negative lethal mutant and it resulted in the isolation of MPH1 gene. Purified Mph1 stimulated the endonuclease activities of both Fen1 and Dna2. This stimulation required neither ATP hydrolysis nor the helicase activity of Mph1. The stimulation of Fen1 by Mph1 was limited to flap-structured substrates through its structure-specific binding activity. Our biochemical and genetic data indicate that Mph1 plays an important, although not essential, role in processing of Okazaki fragments by facilitating formation of ligatable nicks through the stimulation of flap-cleaving enzymes. The Mph1 is basically 3’ to 5’ helicase, however it showed unwinding activities on a variety of substrate with highly sequence-dependent manner. It could unwind partial duplex with 3’ single-stranded overhang, Y structure, 5’ flap, 3’ flap and double flap-structured substrates. Based on this data combined with other’s report that mutator phenotype of mph1 deletion mutant is because of lack of its ATPase and helicase activities, we predict that this helicase is required for certain DNA transactions to maintain genome instability.

Mcm2-7 복합체는 오랫동안 복제 나선효소 (helicase) 일 것이라고 추정되어 왔으나 정제된 단백질이 활성을 가지지 않기 때문에 인산화나 이로 인해 촉진된 다른 단백질과의 결합이 세포 내에서 Mcm2-7 복합체의 구조적인 변화를 가져와 helicase 기능이 활성화 될 것이라고 생각되어 왔다. 최근 초파리에서의 연구를 통해 Mcm2-7이 Cdc45, GINS복합체와 함께 거대 복합체를 이루면서 helicase로서의 활성을 가지는 것이 확인되었다. 이에 근거해 본 연구에서는 고등 동물에서도 이러한 복합체가 존재하는지 확인하기 위한 목적으로 사람의 CMG 복합체를 분리 분리하였고 역시 helicase로서의 활성을 가지는 것을 확인할 수 있었다. 이 복합체는 3’ 에서 5’ 방향으로 이동하면서 이중 나선 DNA를 풀어나가며 fork 구조가 기질에 존재할 경우 그 정도가 증가함을 알 수 있었다. 일부 Mcm 구성체의 ATP motif에 변이를 도입했을 경우는 활성이 감소하였다. 이러한 결과를 통해 CMG 복합체는 진핵생물에 있어서 보편적인 복제 helicase 라고 생각할 수 있다. 발아효모의 Dna2는 lagging strand DNA 합성 시 오카자키 단편의 5’ 끝에 만들어지는 flap구조를 제거하는 작용을 하는 효소이다. Dna2는 helicase와 endonuclease 활성을 가지고 있는데 이들 둘 중 하나라도 제거되면 균주는 살지 못한다. 그러나 Dna2의 helicase 기능이 제거된 균주에 MPH1유전자를 과발현 시키면 세포가 죽지 않는 것이 관찰되었다. 이에 대한 메커니즘을 이해하여 MPH1유전자의 역할을 규명하기 위해 Mph1을 정제하여 생화학적 실험을 수행한 결과 이는 Dna2 및, flap구조 제거에 관여하는 또 다른 단백질인 Fen1의 enodonuclease 활성을 증가시킨다는 것이 확인되었다. 3’->5’ 방향인 Mph1의 helicase 기능을 제거한 단백질 역시 Dna2, Fen1의 활성을 증가시켰고 이는 자체의 helicase 활성을 요구하지 않는 Mph1의 세포내에서의 또 다른 기능이 있음을 의미한다. Fen1은 endonuclease 외에 exnonuclease기능도 가지고 있는데 Mph1 은 exonuclease의 활성을 증가시키지는 못하였고, 이는 Mph1의 기질 특이적인 결합능력에 기인함을 실험을 통해 확인하였다. 또 다른 Dna2 변이균주인 dna2$\Delta$405N 은 Dna2의 N-말단 405개의 아미노산이 결실되어 이으며 이러한 세포는 37℃에서 자라지 못한다. MPH1이 과발현되면 이 균주의 온도민감성을 극복하게 하지만 정제된 Mph1 단백질이 N-trerminal이 제거된 Dna2의 활성을 증가시키지는 못하는 것으로 판단할 때 이러한 온도민감성의 극복은 Fen1의 활성 증가에서 비롯되는 것으로 생각할 수 있다. 위의 관찰결과들에 근거해 볼 때, Mph1은 Fen1의 보조적인 factor로서 작용하여, 세포 내에서 Lagging strand합성 시 생성되는 오카자키 단편 말단의 flap구조를 처리하는 과정이 효과적으로 일어나도록 도와주는 역할을 한다고 제안하고자 한다. 또한 Mph1의 기능을 규명하는 과정에서 이 단백질은 3’->5’ helicase임에도 불구하고 5’ flap구조 기질에서 flap을 포함하는 downstream oligonucleotide를 풀어나가는 것이 관찰되었다. 그 밖에도 이중 flap 구조에서는 5’ flap을 먼저 풀어준 후 3’ flap을 풀며, 3’ flap 구조에서는 3’ flap 과 flap을 포함하지 않는 downstream oligoncleotide를 각각 독립적으로 풀어나가는 것을 확인할 수 있었다. 이러한 다양한 기질을 독특한 방식으로 처리하는 Mph1의 성질은, DNA의 복제나 복구 과정에서 발생되는 다양한 종류의 DNA구조를 풀어주어 유전체 안정성 유지에 기여하는 helicase group인 RecQ family의 특성과 유사하다. 이러한 helicase의 기능은 지금도 계속 연구 중에 있으며, Mph1의 mutator phenotype이 helicase의 효소활성의 결여에서 비롯된다는 다른 그룹의 연구결과를 고려할 때 Mph1은 RecQ family와 같은 혹은 다른 pathway에서 helicase 역할을 하여 세포의 유전체 안정성에 기여한다고 잠정적으로 결론을 내리고자 한다.

서지기타정보

서지기타정보
청구기호 {DBS 09007
형태사항 ix, 126 p. : 삽도 ; 26 cm
언어 영어
일반주기 저자명의 한글표기 : 강영훈
지도교수의 영문표기 : Yeon-Soo Seo
지도교수의 한글표기 : 서연수
학위논문 학위논문(박사) - 한국과학기술원 : 생명과학과,
서지주기 References : p. 102-120
주제 DNA replication,;Helicase,;Okazaki fragment,;CMG,;Mph1
DNA 복제,;나선효소,;오카자키 단편,;CMG, ;Mph1
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