This thesis focuses on the development of novel testing devices to perform correct and efficient evaluation of the effects of electroporation therapies, especially for electrochemotherapy (ECT) and irreversible electroporation (IRE). To accomplish this purpose, two types of microfabricated testing devices were developed; a cell-based in vitro testing device for ECT, and a tissue-based testing device for IRE. The microfabricated cell-based in vitro testing devices for ECT were developed by miniaturizing clinical electroporators with two or six needles into two-dimensional planar electrodes while keeping the similarity of electric field strength distribution. By evaluating the electroporation characteristics of propidium iodide and cell proliferation after ECT of bleomycin with T47D human breast ductal carcinoma cell line, their feasibility was demonstrated and the performances of two- and six-electrode mode operations were analyzed. The tissue-based IRE testing device was designed by miniaturizing a clinical electroporator having two needles. With the in vivo application to rat livers, histological changes in tissues, originated from the influence of electric pulses, were exploited by H&E staining and TUNEL immunohistochemical staining. The proposed testing devices achieved time- and cost-effective experimental procedures compared to those conducted with conventional cuvette type electroporators or clinical electroporators, while the assay results can reflect the electric characteristics of the clinical electroporators. They are expected to serve as an enabling tool not only in the relating cell-based and pre-clinical studies but also in other electroporation-based clinical applications.
전기천공은 암 조직 절제술 분야에서 전기화학 요법, 유전자 요법, 비가역 전기천공 요법, 나노세컨드 전기펄스 요법 등 다양한 형태로 적용되고 있으며, 이러한 기술들의 (전)임상 연구가 본격적으로 진행되면서 세포 및 조직 기반의 시험 도구에 대한 요구가 증대 되어 왔다. 현재 세포 기반의 체외 시험은 주로 큐벳 (cuvette) 전기천공기나 멀티웰 플레이트 (multi-well plate) 에서 임상용 전기천공기를 사용하는 형태로 진행되고 있으나, 이러한 방법들은 여러 가지 기술적 문제점을 안고 있다. 더욱이 조직 기반의 시험도구에 대한 연구는 현재까지 보고된 바 없는 실정이다. 본 논문에서는 미세 가공 기술을 이용하여 전기화학 요법을 위한 세포 실험용 체외 시험소자와 비가역 전기천공 요법 적용을 위한 조직 실험용 시험소자를 개발하여 각각 유방암 세포와 랫 (rat) 의 간 조직에 적용함으로써 그 유용성을 증명하였다.
미세 가공 기술로 제작된 전기화학 요법 용 체외 세포 시험소자는 일반적으로 임상에서 많이 사용되는 두 개 혹은 여섯 개의 바늘 전극으로 구성된 임상용 전기천공기를 미세 평면 전극으로 재 구성하여 제작하였으며, 소자 내의 전기장 분포는 임상용 전기천공기의 전기장 분포와 매우 유사한 특성을 보인다. 본 소자를 이용한 실험에서는 기존의 2D 세포 배양 방법에 기초한 세포 배양과, 전기천공 및 최종 분석에 이르는 전 과정이 소자 내에서 수행되며, 단일 소자 내 여섯 개의 전기천공 위치에서 다중 분석이 가능하다. 제작된 소자를 이용하여 T47D 인체 유방암 세포의 프로피디엄 이오다이드 (PI, propidium iodide) 를 이용한 전기천공 특성과 블레오마이신 (BLM, bleomycin) 을 이용한 전기화학 요법 후 세포 증식 율을 계산함으로써 두 전극 모드 (two-electrode mode) 와 여섯 전극 모드 (six-electrode mode) 의 성능을 비교하였다. 여섯 전극 모드는 회전하는 전기장의 특성으로 인해 0.85 kV/cm 이상의 전기장에서 100% 에 가까운 높은 전기천공 효율을 보였으나, 두 전극 모드는 1 kV/cm 의 전기장에서도 93% 정도의 상대적으로 낮은 전기천공 효율을 보였다. 그러나 낮은 전기 에너지와 연속적으로 변하는 트랜스멤브레인 (transmembrane) 전압의 극 (pole) 위치 특성으로 인해 여섯 전극 모드가 PI 분자의 세포 내 침투 능력 면에서는 오히려 떨어지는 성능을 보였다. 두 전극 모드와 여섯 전극 모드 간에 PI 분자의 세포 내 침투 능력을 대변하는 PI 형광 세기의 차이가 0.7 kV/cm 에서는 1.6 배에 달했으며, 1 kV/cm 에서도 1.3 배에 달했다. 이러한 특성은 전기화학 요법 특성에도 그대로 반영되어 여섯 전극 모드는 두 전극 모드에 비해 상대적으로 높은 $5 \times 10^{-6}$ M 이상의 BLM 농도에서 더 우수한 성능을 보임을 알 수 있었다.
제작된 소자는 단일소자 내 다중 분석이 가능하고, 모든 실험 및 분석 과정이 소자 내에서 수행되며, 간단한 세척에 의한 재활용 등 많은 장점으로 기존의 세포 용 전기천공 실험 방법에 비해 시간 및 비용 측면에서 효율적이다. 또한 큐벳 형태의 전기천공기와 같이 전기화학 반응이나 기포발생 등의 문제가 없고, 분석 과정 중에 trypsin/EDTA 처리나 원심분리 등의 과정이 필요하지 않아 보다 정확한 분석이 가능하다. 무엇보다 중요한 점은 임상용 전기천공기와 유사한 전기장 분포를 가지므로 본 소자로 도출한 실험 결과가 임상용 전기천공기의 전기적 특성을 그대로 반영하고 있다는 점이다.
전기화학 요법은 거의 상용화 단계에 있으나 다양한 전극 구조에 대한 성능 비교, 정상 세포와 암세포, 암세포와 내피 세포 간의 전기화학 요법 민감도, 새로운 전극 구조 및 펄스 모드 개발, 전기화학 요법을 위한 새로운 약물 개발 등 아직은 많은 연구 과제가 남아 있는 기술이다. 개발된 전기화학 요법 용 체외 세포 시험소자 및 분석 방법은 유전자 요법이나, 비가역 전기천공 요법, 나노세컨드 전기펄스 요법과 같은 다른 조직 절제술 연구에 있어서도 중요한 도구가 되리라 기대한다.
비가역 전기천공 요법의 적용을 위해서는 두 개의 바늘 전극을 갖는 임상용 전기천공기를 소형화하여 조직 실험용 시험소자를 제작하였으며, 이 소자는 임상용 전기천공기와 동일한 전기장 분포를 갖는다. 제작된 소자를 랫의 간 조직에 적용한 결과 비가역 전기천공 요법의 영향이 미친 부위와 미치지 않은 부위 사이에 뚜렷한 조직상의 경계를 보였다. 비가역 전기천공 요법의 영향이 미친 부위에서는 동양혈관 내 울혈, 세포막의 파괴, 연한 호산성 세포질, 핵 농축, 공포 변성, 내피세포의 괴사, 혈전 생성, 누출성 출혈 등 기존 임상용 전극을 이용하여 수행한 연구 결과와 거의 유사한 생체 조직상의 변화를 관찰 할 수 있었다.
제작된 조직 실험용 시험소자는 임상용 전기천공기에 비해 실험에 소요되는 시간, 비용 및 동물의 수를 줄일 수 있고, 용이하고 안전한 실험이 가능하며, 현미경을 통한 관찰 용이성 등 많은 장점을 가진다. 비가역 전기천공 요법은 새로이 대두되고 있는 기술로써 다양한 조직의 전기천공 요법에의 민감도, 암세포와 혈관의 전기천공 요법에의 민감도, 명확한 임상조건 규명, 시간에 따른 조직 변화 관찰 등 임상에 적용하기까지 아직 많은 사전 연구가 필요한 분야이다. 제작된 조직 실험용 시험소자와 이에 대응되는 임상용 전기천공기 간에 실험결과의 상호 비교를 통한 추가 검증이 이루어진다면, 비가역 전기천공 요법뿐 아니라 다른 전기천공 요법의 전임상 기초연구에도 매우 효율적인 도구가 될 수 있으리라 생각한다.
