This paper presents a method to encapsulate protein in hydrogel beads using micro-droplet generating and merging technology. Encapsulation of biomaterials in gel is known to increase stability of the encapsulated materials and broaden the range of biological applications from diagnostic devices to the artificial organs. By using the aqueous two-phase droplet generation system described in this report, simple, in-situ formation and manipulation of protein-encapsulated hydrogel beads in a PDMS microfluidic channel is possible. Peptide hydrogel, $PuraMatrix^{TM}$, is used as the gel material, which self-assembles from the sol-state into the nanofiber networks in the presence of salt concentrations. After the sol-state hydrogel droplets of picoliter to nanoliter volume are generated in the focusing channel, they immediately merge with protein solution for gelation and encapsulation. For merging, the microchannel integrates double-T junction, in which the hydrogel droplets pass through the middle channel as in plug shapes, and other solutions flow through the symmetric side branches. This design increases the coalescence frequency and the contact time of the solution with hydrogel droplets, which are the key parameters for merging of dispersed phase liquids in oil phase. The efficiency of encapsulation in hydrogel droplets was up to 100% at various flow rate conditions. To demonstrate the possible applications of the device, the enzyme glucose oxidase is encapsulated in hydrogel and further mixed with the substrate, glucose solution, at the second double-T junction. The enzyme-substrate containing hydrogel beads are monitored by the fluorescence intensity of by-products of the reaction. This device shows the possibility of various biological assay applications, such as protein-protein interaction.
본 연구에서는 단백질과 같은 생체 분자를 하이드로젤 안에 캡슐화하고 이를 다양한 assay에 적용하기 위해 이상(two-phase) 시스템에서 방울을 형성하고, 또 합칠 수 있는 마이크로채널을 개발하였다. 하이드로젤은 생체적합성을 가지고 세포나 효소 등을 화학 처리 없이 물리적인 방법으로 캡슐화 시킬 수 있어 생체 물질 고정에 많이 쓰이는 물질이다. 투명성에 의해 광학 기기를 사용한 분석이 가능하고 젤(gel) 상태가 되기 이전인 졸(sol) 상태에서 마이크로채널을 이용한 유체 제어가 가능하다. 마이크로채널 안에서 섞이지 않는 이상 유체를 사용하여 방울을 형성하게 되면 피코리터에서 나노리터 단위 부피를 가지는 일정한 크기의 젤-비드를 만들 수 있고, 유속에 따라 크기 조절이 가능하다. 또한 방울 단위의 유체는 둘러싼 채널 벽의 전단력에 의해 방울 내에서 대류 흐름이 생겨 일반적인 층류에서 보다 효과적인 유체 혼합을 기대할 수 있다. 그러나 방울 단위의 유체 제어에서 어려운 점은 두 가지 이상의 유체를 합치는 것으로 방울의 크기와 유속, 채널의 형상을 조절하는 방법을 이용하거나, 전기장의 힘을 이용하여 방울을 합치는 방법 등이 연구되고 있다.
본 실험에서는 이중 T 연결부위를 가지는 간단한 PDMS 채널 구조를 이용하여 하이드로젤 방울이 다른 유체와 보다 효율적으로 합쳐질 수 있도록 하였다. 먼저 focusing 채널에서 졸상태의 하이드로젤이 미네럴 오일 내에서 일정한 크기의 방울로 형성됨을 확인하였다. 사용한 하이드로젤은 UV나 특정 화학처리의 필요 없이 약간의 1가 양이온만 있으면 졸에서 젤 상태로 상변이가 일어나는 $PuraMatrix^{TM}$으로, 하이드로젤 방울 안에 단백질 용액을 캡슐화하는 동시에 젤 상태로 굳힐 수가 있다. 하나의 이중 T 연결 구조를 가지는 마이크로 채널을 제작하여 focusing 채널에서 형성된 하이드로젤 방울과 붉은 색소가 합쳐지는 효율을 확인하였다. 유속에 따라서 하이드로젤 방울과 섞이는 색소의 양을 다르게 할 수 있으며, 색소 방울이 하이드로젤 방울의 바로 앞이나 뒤에서 흘러가며 혼합 되도록 하거나, 하이드로젤 플러그(plug)가 그 길이만큼 T 연결부에서 나오고 있는 색소를 끌고 흘러갈 수 있게 하였다. 특히 이중 T 연결구조를 사용함으로써 두 주입부에서 번갈아가며 유체가 흘러나와 한 쪽 색소 주입부의 압력이 높아져 유체가 나오지 못하더라도 나머지 한쪽에서 주입부에서 나온 유체가 하이드로젤 방울과 합쳐질 수 있도록 하였다. 색소와 합쳐진 하이드로젤 방울은 채널을 흘러가며 확산과 대류작용에 의해 혼합이 이루어지고 젤 상태로 변하게 된다. 사용하고자 하는 유체의 확산 특성에 따라 채널 길이와 굽힘 정도를 조절하여 혼합 효율을 조절할 수 있다. 채널 내에서 형성된 하이드로젤-비드 내에서의 효소반응을 확인하기 위한 실험을 위해서는 두 개의 이중 T 연결 부위를 가지는 focusing 채널을 사용하였다. 첫 번째 이중 T 연결 부위에서는 하이드로젤 내에 고정 시키고자 하는 glucose oxidase를 주입하고, 두 번째 이중 T 연결 부위에는 glucose oxidase와 반응하여 H2O2를 생성하는 glucose를 여러 가지 농도로 준비하여 주입하였다. 반응을 현미경으로 관찰하기 위해서 H2O2 양에 따라 붉은 형광을 띠는 Amplex Red를 Glucose oxidase 용액에 포함하여, 형광현미경으로 젤-비드의 형광 세기 변화를 관찰하였다. 두 번째 주입하는 glucose의 농도가 높아질수록, 또 비드가 채널을 흘러가며 시간이 지날수록 형광의 세기가 증가함을 관찰할 수 있었다.
마이크로 방울을 형성하는 기술은 샘플의 양을 최소화하며, 채널 벽이나 방울 간의 비특이적 결합 및 오염을 줄일 수 있고, 유체 혼합 효율을 높일 수 있어 마이크로 유체가 가지는 장점을 최대한 살릴 수 있다는 데에 의의가 크다. 이 기술이 보다 다양한 생체 물질의 실험으로의 적용이 가능하도록 하기 위해서 본 연구는 점성도 등의 특성이 다양한 유체를 사용하여 넓은 유속 범위 내에서, 두 가지 이상의 유체를 합칠 수 있는 마이크로채널을 구현하였다. 또한 마이크로 방울을 젤-비드화 하여 생체분자를 보다 안정하게 고정하도록 하였다. 별다른 준비 과정 및 외부 힘의 필요 없이 채널 내에서 바로 단백질이 포함된 하이드로젤-비드를 형성할 수 있으며, 이를 다른 용액과 효율적으로 합쳐줌으로써 하나하나의 리액터 단위와 ms의 시간 단위의 반응을 관찰 할 수 있다. 이렇게 제작된 하이드로젤-비드 기반의 단백질 분석 시스템은 단백질 상호작용 및 화합물간의 반응, 세포 캡슐화 및 분석에 적용될 수 있을 것으로 기대된다.
