A hairpin-dependent termination site which is classified as Class I signal recognized by bacteriophage T7 RNA polymerases consists of the formation of a secondary structure of a stable stem-loop followed by runs of UTP in the nascent RNA. Interactions between these particular elements together trigger the termination process. Such kind of terminator, e.g. T7-TØ, relies on different termination mechanism compared to the sequence specific termination which is usually called Class II signal. Previously, we have studied sequence specific termination mechanism which involves the conserved sequence (CS). In this study, we followed the kinetic pathway of transcription on E.coli rrnB T1 terminator and observed the sequential pausing character along the terminator upstream the termination site. In addition, we also figured out the elongation competency near the termination site. Elongation complexes of T7 RNA polymerase were stopped at desired positions by stepwise walking. Then we obtained the specific TECs and evaluated their stability via the percentage of retained RNA transcript against time-course. Different terminators were tested and found that the significant abrupt drop of stability took place around two to five base pair upstream the termination site, based on the terminator character, and the release rate of RNA in TEC increased further near the point of termination site. This phenomenon is discrepant to the transcription termination by E.coli RNAP which indicated that all events, including release of RNA transcript, loss of contact of RNA to polymerase and melting of DNA-RNA hybrid happened just at the point of termination site. Therefore, all our data suggested that Class I termination mechanism by T7 RNAP maybe come down to another way-the sequential changes in elongating complex before termination.
파아지 T7 중합효소에 의해서 인지되는 class I 종결 신호는 머리핀 모양의 염기열과 Uridine 이 많은 염기열로 이루어져 있다. 이 두 염기열의 상호 작용으로 전사 종결이 일어난다고 알려져 잇다. 이런 전사 종결 신호 (T7-TΦ)는 염기서열 특이적 종결 신호인 class II 종결 신호와 비교해 볼 때 전혀 다른 전사 종결 기작을 가지고 있다. 이전까지 본 실험실은 염기서열 특이적인 class II 종결 신호를 연구했다. 본 연구에서는 전사 종결 위치의 부근에서의 전사 연장 복합체의 안정성, 전사 연장 효율, 전사 연장 속도에 관한 연구를 진행하였다. 먼저 제한된 종류의 뉴클레오타이드를 넣는 방법을 이용하여 전사 연장 복합체를 원하는 위치에서 정지시킴으로써 머리핀 구조에서의 전사 연장 복합체를 분리하고 각각의 전사 연장 복합체의 안정성을 시간대 별로 측정하였다. 또한 다른 class I 종결 신호에서의 전사 연장 복합체를 분리하고 그들의 안정성을 측정하였다. 전사 연장 복합체의 안정성은 전사 종결 위치에서 2 나 5 bp 앞에서 크게 떨어지기 시작했다. 또한 전사 종결 위치에 가까워 질수록 안정성은 더욱 급격하게 떨어지는 것을 확인할 수 있었다. 지금까지 알려진 class I 종결 신호에서의 전사 종결 기작에서는 전사 연장 복합체의 안정성이 종결 신호에서만 크게 감소하였고 DNA-RNA 복합체의 크기와 단백질과 RNA 간의 상호작용이 역시 전사 종결 신호에 국한해서 일어난다고 보고 되었다. 따라서 이 연구 결과는 기존의 class I 종결 기작 과는 다른 종결 기작을 제시하고 있으며 전사 종결 신호 위치 이전부터 전사 종결 과정이 일어난다는 것을 시사하고 있다.
