Analysis of microbial community of soil of a ginseng field using culture- independent and culture-dependent approaches and description of the first pure-culture representative of phylum OP10 = 배양 비의존 및 의존적인 접근법을 통한 인삼밭 토양의 미생물 군집분석과 OP10 문에서 최초로 순수분리된 대표균의 기술
서명 / 저자 Analysis of microbial community of soil of a ginseng field using culture- independent and culture-dependent approaches and description of the first pure-culture representative of phylum OP10 = 배양 비의존 및 의존적인 접근법을 통한 인삼밭 토양의 미생물 군집분석과 OP10 문에서 최초로 순수분리된 대표균의 기술 / Wan-Taek Im.
저자명 Im, Wan-Taek ; 임완택
발행사항 [대전 : 한국과학기술원, 2006].
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DBS 06015

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The extent of microbial community diversity in two different types of rhizosphere of ginseng (NR & DR) and soil (NS & DS) of a ginseng field (Pocheon, KOREA) was analyzed with a culture-independent and a culture-dependent approach. As the culture-independent method, terminal restriction fragment length polymorphism (T-RFLP) and 16S RNA (SSU rRNA) gene-based approach with about 400-600 SSU rDNA clones were carried out to reveal community of bacterial operational taxonomic units (OTUs). In culture-independent method, total 268 clones were obtained. Several clones (5.2%) obtained from these analysis had sequence more than 20% different from those in the current databases, which mean putative novel phylum candidate. A few of the clones (1.5%) differed by 10-15% in sequence from the database. About 11% of the clones differed by 5-10%, 16% of the clones differed by 3-5%, and 66.5% of the clones differed by only 0-3%, and only 34% of the clones had sequences that were most closely related with cultured bacteria differed by 0-10% in sequence from the current database. This suggests that the sequences of these bacterial clones were highly diverse. Phylogenetic analysis indicated that these sequences fell into 17 of the 35-40 known phylogenetic divisions. Eight sequences had no specific association with any of the known divisions or candidate and phylogenetically divided into five novel division level groups, named after GSO1, GSO2, GSO3, GSO4, and GSO5. The phylogenetic distribution of the sequences between NS and DS samples was similar for the dominant divisions. For example, Actinobacteria was the dominant in both NS (23.0%) and DS (24.1%) samples, followed by Acidobacteria (11.5% and 16.7% for NS and DS samples), Alphaproteobacteria (10.3 and 16.7% for NS and DS samples), Betaproteobacteria (9.0 and 13.0% for NS and DS samples). The proportion of low G+C Gram positive bacteria was low in NS sample and not observed in DS sample. Cytophaga-Flexibacter-Bacteroides group, Gemmatimonadetes, and Chloroflexi also exited with similar ratio. However, there is difference in bacterial phylum, Gammaproteobacteria, Verrucomicrobia, Planctomycetes, and candidate OP10 between two samples. The phylogenetic distribution of the sequences between NR and DR samples was similar for the dominant divisions. Alphaproteobacteria is the most abundant group in rhizosphere of soil samples. Some difference of composition of bacterial phylum constitution was found like comparison of NS and DS samples. It’s hard to find some relationship with respect to root-disease of ginseng analyzing bacterial community with culture-independent methods, because the diversity of bacterial community is higher than as expected and experimental limit. To reveal uncultured bacteria, to get close to real microbial world, and to obtain the genetic resources, it’s urgently necessary to mine uncultured bacteria to try it out with various approaches. Especially, the phylum or subclass such as Acidobacteria, Placntomyces, Verrucomicrobia, Gemmatimonadetes, Acidimicrobidae, Rubrobacteridae, which comprise 2-10% of soil bacterial community and are poorly studied and are represented by few cultured isolates was the target of mining it out. And, such as OP10 candidate division, OD1, and novel phylum candidate GSO groups that are represented by no cultured isolates was the also good aim. Basic approach to cultivate was so simple in low nutrition, long incubation time at natural room temperature condition and to harvest as many as bacterial strain in one plate. 834 strains was isolated and identified appeared on diluted R2A agar. These 834 isolates were affiliated with 14 class-level groups and could be assigned to a total of 58 different family-level groups. Of these 58 family-level groups, 18 (31%) did not encompass validly named or described species. One hundred and one (12%) of the isolates belonged to these novel family-level groups. A further 24 isolates (3%) fell into seven order-level groups. Outstanding discovery was the strain Gsoil 348 which is assigned as OP10 candidate division, which is represented by no cultured isolates. And three numbers of isolate in phylum Acidobacteria, three strains in Verrucomicrobia, and five strains in subdivision Rubrobacteridae were the notable results. The number of species well known as soil-inhabiting members of the phylum including Actinobacteria, Proteobacteria, Bacilli, and CFB group were isolated with a great diversity about 300 species. 433 strains can be classified as the 288 putative genomic novel species. Strain Gsoil 348, first pure cultured bacterial strain of OP10 candidate division, isolated from soil of ginseng field in Pocheon province was characterized and described below: Cells are Gram negative, strictly aerobic, non-motile, and rod shaped, 0.5-0.7 mm in width and 2.5-5.0 mm in length for two week’s culture on 1/2 R2A agar. Colonies grown on a 1/2 R2A agar for 2 weeks were circular, raised with a greasy surface, ivory-pigmented, with 2-4 mm diameter. Catalase is positive but oxidase is negative. Cells grow at 20-30℃ with the optimum temperature at 30℃ and at pH 6.0-8.5 with the optimum at pH 7.0. Growth occurs in the absence of NaCl and growth is inhibited in the presence of 1.0% (w/v) NaCl. It can’t reduce nitrate in aerobic conditions. Anaerobic growth does not occur. It utilizes a limited range of substrates as sole carbon sources. The G+C content of genomic DNA of strain Gsoil 348 was 66.7 mol% (determined by HPLC). The major respiratory quinones of strain Gsoil 348 were menaquinones MK-11 (65%) and MK-10 (32%). MK -12 (3%) was detected with small amount. The fatty acid profile of strain Gsoil 348 was mainly comprised of $iso-C_{15:0}$ (30.9%), 19.5% $iso-C_{17:0}$ (19.5%), $C_{16:0}$ (17.1%), $C_{16:1}$ $\omega11c$ (11.3%), and $iso-C_{13:0}$ 3-OH (5.8%). No DAP isomers were detected from the cell-wall peptidoglycan of strain Gsoil 348 by DAP analysis. Polar lipids detected were phosphatidylethanolmine and other ninhydrin-positive phospholipids.

배양을 하지 않고 핵산작업을 기반으로 하는 미생물 분자생태학적 기법들의 발전으로 인하여 지구상에 서식하고 있는 미생물의 종류가 지금까지 배양된 것보다 훨씬 많은 종으로서 다양하다는 것이 널리 알려지게 됨으로써 여러 환경샘플에서 어떤 종류의 박테리아들이 서식하고 있는가가 계속 연구되고 있다. 이 환경중에서도 토양은 정말로 복잡한 서식환경을 미생물에게 제공하고 있어 실로 미생물의 다양성이 가장 극대화되어 나타나고 있다. 최근에는 시퀀싱기술의 대폭적인 향상과 미생물 종의 정보를 쉽게 가르켜줄 수 있는 16S rDNA의 데이타베이스로 인하여 좀 더 효율적으로 많은 클론을 얻어 분석할 수 있게 되었으며, 많은 수의 균주를 쉽게 동정할 수 있는 시스템이 안정적으로 구축되어 나가고 있는 실정이다. 그래서, 미생물의 다양성을 보고자 할 때는 배양비의존적인 방법인 분자생태학적 기법들을 이용하여 배양의존적인 여러 배양방법들보다 빠르고 정확하게 볼 수 있게 되었으며, 또한 다양한 배양방법을 이용하여 기존에 분리하지 못한 균을 분리한다면 새로운 생리특성을 가진 균주들을 연구하여 여러 용도로 응용할 수 있는 가능성이 열리겠다. 본 연구는 처음에 인삼밭에서 배양연도에 따른 그리고, 병발생의 유무에 따른 인삼밭 토양내 박테리아의 군집분석을 미생물분자생태학적 기법의 하나인 T-RFLP를 이용하여 그 연관성을 찾고자 하였으나 어떤 특정한 박테리아의 의한 병발생이나 군집이동은 찾아볼 수 없었다. 더욱이 박테리아의 다양성이 T-RFLP기법의 한계를 넘어서 있어서 좀 더 세밀하게 관찰할 수 있는 16S rDNA 클론라이브러리 제작을 시도하여 분석하였다. 정상인삼이 자라는 토양 (NS), 병든인삼이 자라는 토양 (DS)과 그 각각의 토양샘플에서 자라는 인삼에서의 근권 (NR, DR), 이 4가지 샘플을 이용하여 총 268개의 클론분석을 수행하였다. 그 결과 지금까지 잠정적으로 알려진 35-40개의 박테리아 문 (phylum)중에서 17가지 종류가 발견되었으며, 이미 보고되어진 박테리아 문과는 상당한 유전적 거리가 있어 새로운 문이 될 가능성이 있는 클론들이 5종류나 발견되었다. 또한 분석된 클론 (66%)은 대부분 배양되지 않은 박테리아 클론들과 상동성이 높았으며, 34%의 클론만이 배양된 박테리아와 0-10% 16S rDNA 차이가 있는 정도를 보였다. 하지만 이 배양된 박테리아 또한 대부분 정식으로 분류되지 않아 정확하게 명명되어지지 않는 비공인 균주들이었다. 그 특성을 연관시키기에는 무리가 있는 거리였다. 공인된 종과 16S rDNA 상동성 97% 이상을 보이며 같은 종의 가능성을 보여주는 클론은 2% 이내였다. 또한 분석된 클론들은 대부분 겹치지 않은 OTUs 이어서 실험스케일이 커지면 그 다양성은 계속해서 커질 가능성을 가지고 있었다. NS와 DS 샘플 비교분석의 결과 우점 역할을 하는 박테리아의 문은 비슷하게 나왔고, 작은 부분을 차지하는 박테리아 문들에서는 약간씩 그 비율 차이를 보였다. 근권샘플 (NR, DR)에서는 근권미생물이 있는 Alphaproteobacteria 가 40%의 비율을 보이며 높게 차지하였으며, 여러 토양에서 보이는 다른 문들도 각기 나타났다. 이렇듯 배양비의존적인 방법을 통한 인삼밭 토양샘플 분석을 통해서는 샘플의 상태랑 뚜렷한 상관관계를 보이는 점은 찾을 수 없었고 실험결과는 박테리아의 다양성이 실로 방대하다는 것으로 나타났다. 그래서, 이렇게 토양내에는 분명히 존재하지만 아직까지 인간들 손에 배양이 되지 않은 막대한 유전적 자원인 박테리아들을 직접 분리하고자 하였다. 특히 아직까지 많은 종이 분리되지 않았지만 엄연히 토양에서는 그 점유율이 2-10%까지 되는 Acidobcteria, Planctomycetes, Verrucomicrobia, Gemmatimonadetes, Acidimicrobidae, Rubrobacteridae 이런 종류의 그룹과 배양이 전혀 되지 않는 그룹인 OP10, OD1, 그리고 직접 분석하여 잠정적 결론을 내린 5개의 새로운 문을 구성하는 박테리아들을 분리하고자 하였다. 방법은 약간씩 변화를 주긴 하였지만 기본 접근방법은 간단하게 배지농도를 낮춘 주로 1/5 R2A (유기물 함유량 약 0.5 g/L) 미디어를 이용하여 실온배양과 더불어 장기 최장 2달까지 플레이트에서 생성된 콜로니를 가능한 많이 획득하여 동정하였다. 배양할 수 없는 것이 아니라 단순히 배양하지 않아서 알려지지 않은 박테리아들이 무수히 많다는 것을 나타내보이고 싶었다. 834개의 균주들을 확보하였고 이중에서 위에서 언급한 그룹에 속하는 균은 Acidobacterium 3 균주, Verrucomicrobium 3균주와 Rubrobacteridae에 속하는 5균주를 확보할 수 있었다. 하지만, 이것보다도 눈에 띄는 결과는 아직까지 전혀 배양이 되지 않고 클론만 무성한 (약 100여개) OP10 그룹에 속하는 균을 최초로 순수분리한 것이다. 그리고 일반적으로 잘 분리되어지는 방선균그룹 (Actinomycetales), 그람음성 세균 (Alpha-, Beta-, Gammaproteobacteria, 및 CFB 그룹), 바실러스그룹 에서는 도합 300종이상이 분리가 되었고, 이중 새로운 종으로 분류되어질 수 있는 균은 485 균 288여종정도였다. 이중 혐기성 특성이 있거나 분류학적 가치가 있는 70여종을 골라 새로운 이름을 지어 등록중이다. 순수분리된 박테리아 균주가 없는 잠정적인 박테리아 문 OP10 그룹에 속하는 Gsoil 348이라고 표시된 박테리아가 순수분리되어져서 생리, 생화학, 화학분석을 통하여 그 특성을 밝히고자 하였다. 그람음성, 절대호기성, 운동성이 없었으며, 간균이었다. 굉장히 제한적인 탄소원을 이용하였으며 1/2 R2A agar 배지, 30도, pH 7 조건에서 최적의 성장을 이루어 일주일이 지나야 눈에 띄게 자랐다. 그리 늦게 자라는 것은 아니었지만 배지 농도 (영양성분 농도)가 2 g/L를 넘어가면 저해를 받아 잘 자라지 않았다. 이 균은 최초 분리시에 도말 후 한달 이상이 지나 작은 콜로니를 형성한 것을 획득하여 얻은 균으로서 자라는 속도가 느리고 저영양성 배지에서 자라는 균이었다. Glucose, galactose, mannose, fucose등과 adipate, tartaric acid, itaconate, malonate와 같은 dicarboxylic acid 류를 이용할 수 있었다. 여러 화학적인 특성은 다음과 같았다. 전체 유전자의 G+C 함유량은 66.7%였고, 함유된 lipoquinone은 주로 MK-11 (65%), MK-10 (32%)였고 MK-12 (3%)는 소량 존재하였다. 또한 주요한 지방산은 $iso-C_{15:0}$ (30.9%), 19.5% $iso-C_{17:0}$ (19.5%), $C_{16:0}$ (17.1%), $C_{16:1}$ ω11c (11.3%), and $iso-C_{13:0}$ 3-OH (5.8%) 로 구성되어 있었다. 그람음성 세균의 세포벽에 주로 존재하는 DAP가 없는 게 하나의 특징이었고, 함유된 인지질은 phosphatidylethanolmine과 닌하이드린 양성 인지질이 있었다.


청구기호 {DBS 06015
형태사항 x, 121 p. : 삽도 ; 26 cm
언어 영어
일반주기 Includes appendix
저자명의 한글표기 : 임완택
지도교수의 영문표기 : Sung-Taik Lee
지도교수의 한글표기 : 이성택
수록잡지명 : "Pleomorphomonas koreensis sp. nov., a novel nitrogen-fixing species in the order rhizobiales". International journal of systematic and evolutionary microbiology, v.56, (2006)
학위논문 학위논문(박사) - 한국과학기술원 : 생명과학과,
서지주기 Reference : p. 102-108
주제 Soil of ginseng field
Bacterial community
Bacterial diversity
Polyphasic taxonomy
OP10 clade
인삼밭 토양
박테리아 군집
박테이아 다양성
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