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Production of lycopene and β-Carotene from metabolically engineered escherichia coli = 대사공학적으로 개량된 대장균으로부터 라이코펜과 베타카로텐의 생산에 관한 연구
서명 / 저자 Production of lycopene and β-Carotene from metabolically engineered escherichia coli = 대사공학적으로 개량된 대장균으로부터 라이코펜과 베타카로텐의 생산에 관한 연구 / Sung-Woo Kim.
저자명 Kim, Sung-Woo ; 김성우
발행사항 [대전 : 한국과학기술원, 2006].
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초록정보

We generated recombinant lycopene and β-carotene utilizing metabolically engineered Escherichia coli DH5α. For this purpose, we constructed synthetic operons regulated by the araBAD promoter. Vectors harboring these operons exhibited diverse expression patterns dependant upon plasmid copy number. Carotenoid production from these recombinant E. coli was either constitutive or inducible depending upon plasmid copy number. Furthermore, the yields of both lycopene and β-carotene in E. coli cultures harboring high-copy vectors (pTB-EIB and pTB-EIBY) varied depending upon inocula state. This inocula dependence, solely associated with use of high copy vectors, was overcome through using low-copy vectors (pTB-EIBrop and pTB-EIBYrop) for recombinant carotenoid production. We performed fermentation process from laboratory-scale to pilot-scale. Various cultivation conditions, including temperature, medium composition, and induction time, were investigated and determined for high-level production of lycopene and β-carotene. Interestingly, lycopene and β-carotene were greatly increased at low-temperature condition (25 ℃). Through fed-batch fermentation in 300 L-bioreactor, maximal lycopene production reached up to 99 mg $l^{-1}$ with 2.3 mg $g^{-1}$ DCW. In addition, using this same technique, β-carotene production reached up to 110 mg $l^{-1}$ with 2.2 mg $g^{-1}$ DCW. Although carotenoid content per cell is relatively low, our results showed that the high-level production of carotenoids could be achieved by optimizing culture conditions at various fermentation scales. Previous sequence analyses of the lycopene cyclase gene (crtY) revealed the protein product was translated from the ATG start codon in Escherichia coli. We found, however, this enzyme could be also obtained without ATG start codon. The research using crtY mutants revealed the GTG (Val) sequence located in-frame 24 bp downstream of the ATG was a potential start codon. This result suggests that the GTG should be an alternative start codon and the 9 amino acids from N-terminus of crtY should little affect β-carotene production. Furthermore, the amino acid sequence alignments of lycopene cyclases from different sources implied the Val residue could be the key player for the alternative translation initiation. Especially, Asp (GAT or GAC), the conserved amino acid, located in-frame upstream of potential translation codon suggests that it should be able to function as the part of Shine-Dalgano sequence (UAAGGAGG).

라이코펜 과 베타카로텐은 오랜 기간동안 다양한 임상실험을 거쳐 인체에 매우 유용한 물질로 판명되어 전 세계적으로 각광을 받고 있으며, 그 소비도 날로 증가하고 있다. 특히, 천연물로서의 이들에 대한 수요가 급증함에 따라 기존의 화학합성 방법에 의한 생산 방식을 대체하려는 움직임이 일고 있으며, 그러한 대안으로 미생물, 특히 대장균을 숙주로 하여 대사공학기법을 이용함으로써 카로테노이드를 생산하고자 하는 시도가 진행되어 왔다. 다만 이들 연구가 균주 개발에만 치우쳐 있어 학문적 영역에서의 결과는 많이 축적되어 있으나 실제 산업에 적용하기는 아직 요원하다. 따라서 본 연구에서는 라이코펜과 베타카로텐의 대량 생산에 목적을 두고 이러한 목적에 부합하도록 벡터를 설계하고 파일럿 규모 (300 L) 까지 발효 배양을 시도 하였다. 대량 생산용 벡터는 아라비노스 유도성 프로모터에 의해 조절되도록 합성 오페론 (synthetic operon)을 설계하였으며, 벡터의 복제 수 및 카로테노이드 생합성 유전자의 배치를 고려하여 제작하였다. 본 연구에서는 라이코펜 생산용 벡터 (pTB-EIB, pTB-EIBrop, pTB-EI4B, pTB-EI4Brop) 와 베타카로텐 생산용 벡터 (pTB-EIBY, pTB-EIBYrop) 그리고 카로테노이드 생합성 전구체의 양을 증가시킬 목적으로 제작한 벡터 pATrc::idi 등을 이용하여 발현양상과 생산량 등을 확인하였다. 높은 복제 수율을 가지는 벡터로 형질전환 된 균주는 유도체의 첨가 없이도 카로테노이드를 생산해 내었다. 더욱이 SDS-PAGE를 통하여, 과도하게 발현된 생합성 유전자가 카로테노이드의 생산량을 오히려 감소시키는 것을 확인하였다. 따라서 카로테노이드의 생합성은 소량의 생합성 관련 유전자의 발현 (basal level expression or leaky expression) 만으로도 충분히 이루어질 수 있음을 확인하였고, 과도하게 발현된 생합성 유전자는 거의 inclusion body를 형성하여 오히려 그 기능을 상실하는 것을 알 수 있었다. 또한 이들 형질전환체는 계대 배양 과정에서도 커다란 문제점을 노출시켰다. 다시말하면, 지수성장기 $(O.D_{600}≒0.5-1)$ 에 계대 배양이 이루어지면 이후 카로테노이드 생산에 크게 영향을 미치지 아니하지만, 지수성장기 말기 $(O.D_{600}≒1.0)$ 이후에 계대 배양이 이루어지면 생산성이 크게 감소하였다. 특히 $O.D_{600}≒3.0$ 또는 overnight seed를 사용하게 되면 카로테노이드를 전혀 생산하지 못하였다. 이러한 원인은 seed에 사용되는 세포의 상태가 계대 배양 이후 플라스미드의 안정성에 심각하게 영향을 미친다는 실험 결과에서 찾을 수 있었으며, 그 결과로 최종산물인 카로테노이드의 생산이 좌우되는 것으로 나타났다. 이와 같은 basal level expression 과 inocula dependence는 산업화를 위한 고농도 배양에 큰 걸림돌로 작용하기 때문에 보다 발현시스템의 통제가 잘 이루어지며, inocula dependence의 영향을 덜 받는 벡터의 개발이 요구되었다. 이와 같은 벡터는 pBR322의 rop 유전자를 기존의 고 복제 수 벡터에 삽입함으로써 저 복제 수 벡터로의 전환이 가능하였으며, 이를 통하여 고 복제 수 벡터로부터 야기된 문제들이 해결되었다. 저 복제 수 벡터를 함유한 형질 전환체는 basal level expression 및 inocula dependence의 양상을 나타내지 아니하였으며 1 mM의 아라비노스 농도에서 최대 카로테노이드 생산량을 보이는 것으로 확인 되었다. 이때의 카로테노이드 생합성 유전자의 발현양상 역시 SDS-PAGE 상에서 대조군과 비교가 되지 않았으며, 카로테노이드 생산에 필요한 관련 유전자들은 매우 적은 량으로도 그 기능을 수행하는 것으로 판단되었다. 카로테노이드 생산량을 증가시키기 위하여 다양하게 생산조건이 검토되었다. 본 실험에 사용된 벡터에 영향을 줄 수 있는 다양한 대장균 균주를 선정하여 실험한 결과 DH5α 균주가 카로테노이드 생산에 최적인 균주로 결정되었으며, 이를 통한 배양 결과, 온도 및 배지 조성에 따라 생산 수율에 있어서 커다란 차이를 나타내었다. 저온 (25℃) 에서의 배양은 고온 (37℃)의 배양보다 수율 뿐만 아니라 HPLC 상의 순도 면에서 더 나은 것으로 확인 되었다. 5 L 에서 300 L 발효조에 이르기 까지 성공적인 스케일-업 공정을 수행하였으며, 그 결과로 300 L 발효조에서 라이코펜과 베타카로텐을 각각 99 $mgl{-1}$ 와 110 $mgl^{-1}$ 의 수율로 확보하였다. Lycopene cyclase 의 site-directed mutagenesis를 수행하는 과정에서 이 효소가 번역 (translation) 과정에서 기존에 알려져 있는 ATG start codon 이외에, 유전자 내부 서열에 alternative translation spot 이 있음을 확인하였다. 다양한 site-directed mutagenesis를 통하여 10번째 아미노산인 Val (GTG) 이 start codon으로 사용될 수 있음을 확인하였고, 생합성된 카로테노이드의 양을 통하여 아미노산 N-말단의 9개 아미노산은 이 효소의 기능에 크게 참여하지 않는 것으로 확인되었다.

서지기타정보

서지기타정보
청구기호 {DBS 06017
형태사항 vii, 112 p. : 삽도 ; 26 cm
언어 영어
일반주기 저자명의 한글표기 : 김성우
지도교수의 영문표기 : Jung-Hoe Kim
지도교수의 한글표기 : 김정회
수록잡지명 : "Over-production of β-Carotene from metabolically engineered Escherichia coli". Biotechnology letters, (2006)
학위논문 학위논문(박사) - 한국과학기술원 : 생명과학과,
서지주기 Reference : p. 97-107
주제 β-Carotene
Lycopene
Metabolic engineering
베타카로텐
라이코펜
대사공학
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