The canine species including wolf and jackal have four digits on the hindlimb. It was thought that an extra first digit on the hindlimb, named dewclaw, is a hereditary defect. For genetically related canine pedigrees with seventy-three members of dewclaws, we carried out a genome-wide scan for linkage with microsatellites. With an assumption of autosomal dominant mode of inheritance, significant linkages were detected for the markers on the canine chromosome 16 (CFA 16). The maximum two-point LOD score of 20.76 was obtained for the REN85M08/REN85N14 markers at a recombination fraction of 0.00. A chromosome-wide haplotype analysis revealed the location of dewclaw locus within a few centimorgan intervals delimited by the UCMCF12 and CXX876 markers. Thus, the results indicate that the affected gene to dewclaw in the Korean breed is located on the CFA16. The chromosome is known to have syntenic relationships with the human chromosomes of 4q, 7q, and 8p. Using a synteny with the HSA 7, appropriate single-nucleotide polymorphism (SNP) markers with overlapping BAC libraries were screened and exploited to further narrow down the candidate locus into approximately two hundred kilobases. This was based on linkage disequilibrium (LD) mapping with affected individuals from the Korean breed as well as from other breeds showing allele association for the candidate locus. The affected chromosomal region contains a single C7orf2 gene. C7orf2 intron S containing the region called ZRS (ZPA regulatory sequence) has been implicated in mouse and human polydactyly. SNP typings on two thirds of the C7orfl gene including ZRS led us to define intensive LD block with more than 100 Kbs. Analysis of the haplotypes within the LD Block for individuals from 14 and 6 breeds of western and Asian origins, respectively, revealed that only a subset of five haplotypes are attributed to the western breeds among the total of nine haplotypes. The haplotype analysis with pedigree or its associations by chi-square statistics indicate two distinct affected LD haplotypes, one for Asian and the other for western breeds. DNA sequencing of the conserved intronic regions including the ZRS from each affected haplotypes revealed differences in their mutational changes, both involved with a single base, in the multi-species conserved sequence (MCS) region, implying two independent occurrences of canine polydactyl mutations in their lineages to Asian and western breeds. The results have implications on the recent and multiple origins of canine polydactyl mutations, perhaps through population bottlenecks. This conserved region exhibits transcription enhancing activity in cultured cells when fused to the luciferase reporter, while an introduction of the polydactyl mutation caused a reduction in its activity. In transgenic analysis, spatio-temporal expressions of the MCS region are also observed in ZPA region which Shh (sonic hedgehog) expressed in normal limb development. The results imply canine polydactyly mutations on expanded ZRS region with heterogeneous origin are involved in limb development, although functional relationship between Shh and the region is not directly established.
늑대나 재칼을 포함하는 개과는 뒤쪽사지에 4개의 발가락을 가진다. 덧발톱이라고 명명되는 뒤쪽사지에 추가적인 첫번째 발가락은 유전전인 결함이다. 덧발톱을 가지는 73마리의 유전적으로 관계된 개의 가계도를 기반으로 microsatellite를 가지고 연관분석을 통해 지놈 와이드 스캔을 하였다. 유전적 우성모드에서 중요한 연관이 개의 염색체 16번에 위치한 마커에서 탐지되었다. 최대 two-point LOD값인 20.76 이 재조합률 0.00인 REN85M08/REN85N14마커에서 얻어졌다. 염색체 전체의 haplotype분석은 덧발톱의 유전자위가 UCMCF12와 CXX876 마커사이의 몇 센티몰간 안임을 밝혔다. 즉 이러한 결과들은 한국품종에 덧발톱을 위한 유전자가 염색체 16번에 위치함을 나타낸다. 그 염색체는 인간 염색체 4q, 7q, 와 8p 부분과 syntenic 유연관계가 있는것으로 알려져 있다. 인간염색체 7번의 syntheny를 이용해서 겹쳐지는 BAC라이브러리와 적절한 single-nucleotide polymorphism (SNP) 마커를 대략 이백 킬로베이스안으로 후보 유전좌위를 더 좁히는데 이용되었다. 이것은 후보유전좌위를 위한 관련 대립유전자를 보여주는 다른품종들 뿐 아니라 한국품종에서의 affected 개체에서의 linkage disequilibrium (LD) mapping에 기반하였다. 그 영향 있는 염색체상의 영역은 C7orf2 유전자 하나만 포함한다. ZRS 영역을 포함하는 C7orf2의 인트론5는 마우스와 휴먼의 다지증과 관련된것으로 보고된다. ZRS를 포함하는 C7orf2 유전자 부분에 위치하는 SNP들의 타이핑은 약 100 킬로베이스정도의 집중적인 LD블록의 경계를 한정하였다. 서양견 14품종과 동양견 6품종을 통한 그 LD블록안의 haplotype분석은 전체 9개의 haplotype 중 오직 5 haplotype정도의 일부분만이 서양품종에 기인된다는 사실을 밝혀내었다. 가계도에서의 haplotype 분석과 카이-스퀘어 통계분석을 통한 관련은 각각 서양품종과 동양품종을 위한 두개의 뚜렷한 affected LD haplotype들을 이끌어 내었다. 각각의 affected haplotype에서 ZRS를 포함하는 보존된 인트론 영역의 DNA 시컨싱을 통해 다양한 종들에서 보존된 영역 (MCS)에서 하나의 베이스가 다른 돌연적 변이의 차이를 밝혀내었고 이것은 동양과 서양견 품종의 계통에서 개의 다지증 돌연변이의 두개의 독립적인 발생을 암시한다. 또한 이러한 결과들은 개의 다지증 돌연변이의 최근의 다양한 기원을 암시하고 이는 아마 집단적 보틀렉을 통해 생겨났을 것이다. 이러한 보존된 영역은 luciferase reportor를 결합시켰을 때 배양된 세포에서 전사를 향상시키는 활동이 관찰되었으며 이는 다지증 돌연변이를 도입시켰을 때 활동이 감소되는 현상이 나타났다. 트랜드제닉 분석에서 이러한 다양한 종들간에 보존된 영역 (MCS)은 또한 정상적인 사지의 발생과정에서 Shh이 발현하는 ZPA 영역에서 공간적 시간적 발현을 관찰하였다. 즉, ZRS 영역과 shh간의 직접적인 기능적 관련성을 설명하지 못하더라도 이러한 결과들은 외생 (heterogenous)의 기원을 가지는 확장된 ZRS 영역에서 발견된 개의 다지증 돌연변이들이 사지의 발생에 관여하는 것을 암시한다.
