The cell membranes of a number of extremely halophilic bacteria, such as Halobacterium salinarium, contain highly organized patches of a purple membrane (PM) which functions as a light-driven proton pump. The purple membrane contains a single protein, - bacteriorhodopsin (MW, 26,500), this has recently been suggested to have several applications in the design of molecular electron devices and optical computers since it possesses desirable photophysical/chemical properties.
To find out characteristics for cell growth and the productivity of BR, several batch fermentations, including 50L pilot scale, were performed by Halobacterium salinarium wild type strain. The average productivity of BR was 0.110 mg/Lㆍh in batch mode and there was little increase of productivity (0.145 mg/Lㆍh) in 1L batch fermentation when used high purity oxygen as supplied gas. Instead of fed-batch fermentation, repeated batch was selected as alternative for BR production. The result for productivity, in that case, was 10 times higher than batch one, but has not lasted after 72 hours (for 3-steps medium-feeding periods). The final average productivity of BR was 0.207 mg/Lㆍh in repeated batch mode. To remove inhibitory-product and give more stable condition to cell, continuous cell recycle culture with external membrane and air was carried out by Halobacterium salinarium wild type strain. The final amount of BR and productivity was 177mg/L, 0.96mg/Lㆍh, respectively. This amount of BR was 10 times higher than in a batch mode. Also experiment by Halobacterium salinarium mutant D96N with high purity oxygen was done and obtained the result, which was 21.5 times higher than in a batch mode and 2.41 times higher than in continuous mode with air.
The purification process of protein from cells contain a lot of phases such as harvesting, disruption of cell, concentration of protein, polishing for high purity final product, removal of salts or impurities. The most important phase of them is a concentration phase, because losses for step yield can be serious problem in this phase. Also purity of protein in this middle phase of whole processes can be increased, which result in increasing efficiency of final polishing phase. Isoelectric precipitation is based on the fact that the solubility of a given protein is generally at a minimum at the isoelectric point (pI) of the protein. This technique was selected as concentration method for concentrating protein and 81% protein purity was obtained as protein purity in this phase.
The final polishing process in BR production can be performed by only gel permeation technique or density gradient ultracentrifugation. In this study, more efficient material and condition was found out by modifying centrifugal condition. Instead of sucrose, glycerol was possible in final purification as density gradient material.
박테리오로돕신(Bacteriorhodopsin)은 고농도 염의 조건에서 자라는 호염성 세균인 halobacteria에서 발견되는 막 단백질로서 빛의 파장에 따른 색깔 변화가 관찰되며, 빠르고 가역적인 photocycle을 거쳐 다시 원래 상태로 돌아오는 등 광화학적 성질이 특이하여 전자 소자에 응용하는 연구가 계속되고 있다.
본 연구에서 최근에 BR의 성능에 초점을 두어 가장 연구가 활발히 진행되고 있는 Halobacterium salinarium mutant D96N을 이용한 연속발효를 실시하고자 하였다. Wild type strain의 회분식 발효로부터 기초 데이터를 수집한 후 50L 발효조를 고안하여 스케일업을 시도하여 회분식 발효에서의 생산성에 대한 재현성을 확인하였다. 이를 바탕으로 공기 및 순수산소를 이용하여 일정간격으로 세포를 회수하고 신선한 배지를 공급하는 반복된 회분식 발효 및 막을 이용한 외부 세포 재순환 방식의 연속 발효를 실시한 결과 회분식 발효보다 약 10배에서 20배까지 생산성 향상을 보였다. 막을 이용한 고농도 세포배양에서는 세포농도의 증가가 10배인 반면, BR생산량은 20배로 증가함을 알 수 있었으며, 이는 고농도의 세포가 빛에 의해 발현하는 BR의 발현 촉진 환경을 제공해서, BR 생산성의 증가를 유발한 것이라 판단된다.
단백질 정제의 전체 공정중 대분분의 수율 저하는 농축과정에서 발생하고, BR의 분리과정에서 최정정제 전 단계인 이 부분에서 수율이 많이 저하되는 현상이 발생하였다. 더불어 이 단계에서 순도를 높여 초원심분리나 GPC를 이용한 최종 정제단계에서의 비용 및 시간을 절감하기 위한 농축법 개선에 대한 연구를 실시하였다. 대부분의 단백질은 등전점에서 최소의 용해도를 갖는다는 점에 초점을 두어 BR을 등전점 근방에서 침전시켜 불순물들을 최대한 제거하려 하였다. 특정한 충진제로 충진된 크로마토그래피용 칼럼을 통해 침전된 단백질을 용출시킨 결과 침전되지 않은 단백질은 충진제에 걸리지 않고 용리되는 현상을 보였으며, 충진제에 의해 여과된 단백질을 증류수를 사용하여 재용해시킨수 반복실험을 통하여 81%의 순도로 단백질을 얻을 수 있었다.
현재까지 BR을 분리하는 방법은 밀도구배에 의한 초원심분리이거나 분자량의 크기에 따른 젤 여과 크로마토그래피에 의한 분리가 전부이다. 단백질 농축단계에서 등전점 침전법을 이용하여 단백질의 순도를 높인 후, 초원심분리에서의 효율성을 개선하기 위해 원심분리 조건을 개선하였다. 밀도구배를 제공하는 용액은 sucrose대신에 glycerol을 사용하였고, 저속 원심분리를 시도하였다. 등밀도에서 시작하여 분리과정이 진행됨에 따라 밀도구배가 형성되는 isopycnic separation 방법을 통한 결과는 sucrose가 약간의 효율이 좋았을 뿐 저속원심분리가 불가능하였으며 이는 sucrose나 glycerol의 저분량에 기인한 것으로 보인다. 미리 구성된 밀도구배에서의 단백질 분자들간의 시간에 따른 침강속도차이를 이용한 rate separation방법에서는 sucrose를 이용한 초원심분리와 glycerol을 이용한 저속원심분리가 비슷한 결과를 보였으며, 이는 단백질 농축단계에서 순도를 높여 최종정제단계에서의 효율성이 높아진 것으로 보인다. 원심분리에 의한 분리공정의 단점은 스케일업이 어렵다는 것이지만, 상대적으로 많은 용량의 분리가 가능한 저속 원심분리로 단백질을 분리할 수 있었다는 결과는 분리에 대한 스케일업에 대한 가능성을 보여준다.
