This thesis reports a microchip-based electrochemical immunoassay with surface-functionalized poly(dimethylsiloxane) (PDMS) channel. While the standard microtiter plate-based immunoassay has required a long incubation time, large sample volumes, and tedious labors, the microchip-based immunoassay gives a solution against those drawbacks by integration of analytical sequences in microscale. In this study, a 3-electrode system for electrochemical detection, fabricated on a glass substrate by photolithography, was assembled to the PDMS channel by plasma treatment. For the effective immobilization of target antibodies, the internal surface of the PDMS channel was chemically modified into the silane monolayer containing the poly(ethyleneglycol) groups, which minimized non-specific binding. Additionally, the low height (50㎛) of the channel enables a rapid immunoassay by reducing the incubation time to 1 min. We chose the mouse IgG as a model analyte for sandwich immunoassay. A low detection limit of 485pg/mL was obtained at 95% confidence level. Furthermore, liquid handling was controlled by a syringe pump preserving a constant channel volume (0.7μL), which was free from tedious separation steps and erroneous volume control. Such an on-chip integration of immunological and enzymatic reactions, amperometric detection, and microfluidic separation system allows performing immunoassays more rapidly, easily, and economically.
본 논문에서는 기능화된 표면의 폴리디메틸실록산 채널이 있는 미세칩 기반의 전기화학적 면역분석법에 관한 연구를 수행하였다. 기존의 면역분석법은 96-웰 플레이트 등과 같은 플레이트 기반의 면역흡착제 분석법 (ELISA)으로 수행되어 각 분리 과정마다 수동으로 작업을 행해주어야 하며, 웰의 크기 요소로 인하여 비교적 많은 시약의 양이 필요하며, 항원-항체 반응 시간이 수 시간이 필요하다. 이러한 단점을 극복하고자, 본 논문에서는 채널 구조를 가지는 마이크로 단위의 미세칩을 제작하였다. 제작된 미세칩은 3개의 금 전극－ 작업, 상대, 기준 전극－ 이 형성되어 있는 유리 기판이 있어 면역 분석 신호를 전기화학적으로 검출할 수 있으며, 이의 측정회로는 기존의 전자회로와 맞물릴 수 있어 휴대용 분석기기(point-of-care device)에 응용되기 쉽다. 또한, 형성된 전극의 유리기판 위에 폴리디메틸실록산(PDMS) 소재의 고분자 채널로 구성되어 플라즈마(plasma) 처리에 의해 접합되어 있어, 채널 내벽의 화학특성을 적절히 변화시켜 대상 항체를 효과적으로 고정화시킬 수 있다.
본 연구에서 제작된 미세칩에서는 샌드위치 방식의 면역분석을 하기 위하여 대상 항체를 채널 내벽의 특성을 변화시켜 비가역적으로 고정화시켰다. 우선, 플라즈마 처리된 PDMS 채널 내벽에 비닐(vinyl) 기를 말단 작용기로 가지는 할로겐화 실란(silane) 용액을 반응시켜 단일 실란막을 형성시킨 후, 비닐기를 산화시켜 카르복실(carboxylic)기 끝을 가지는 단일막으로 변형시켰다. 마지막으로 폴리에틸렌글리콜(PEG) 그룹을 가지며 말단 그룹으로 바이오틴(biotin) 분자가 있는 아민(amine) 분자로 실란막의 표면을 변화시켰다. 마이크로 단위의 채널에서는 단위 부피 당 면적비(S/V ratio)가 커지며 PDMS 소재의 소수성 특징으로 비특이성 결합반응(non-specific binding)의 효과가 증가하여 면역분석의 감도가 떨어지게 마련이나, 본 연구에서는 PDMS 채널 내벽의 표면화학특성을 변화시켜 PEG 그룹을 가지게 하여 변형된 단일막의 친수성과 유동성이 증가하여 비특이성 결합반응을 크게 막을 수 있다. 또한, 아비딘-바이오틴(avidin-biotin) 결합반응을 도입하여 대상 항체를 고정화하여 기존의 흡착에 의한 고정화에서 오는 낮은 감도와 재현성을 극복하였다. 샌드위치 방식의 대상 항원항체 시스템의 모델로써 면역글로블린 쥐(immunoglobulin G, IgG) 짝을 도입하여 실험적으로 증명하였다. 다양한 농도의 IgG를 검출할 수 있었으며, 측정한계는 485pg/mL로 95퍼센트 신뢰도를 가지고 얻을 수 있었다. 효소 라벨로는 알칼라인포스퍼테이즈(Alkalinephosphatase)를 이용하였으며, 효소 기질인 파라아미노페닐포스페이트(PAPP)를 반응시켜 효소 반응으로 생성된 생성물 파라아미노페닐(PAP)을 전극에서 순환 전압전류법(cyclic voltammetry)으로 PAP가 산화전위에서 산화될 때의 산화최고전류(oxidation peak current)를 측정하였다.
전기화학적 측정을 위한 금 전극은 금이 증착된 4인치 파이렉스 유리 웨이퍼에 마이크로공정 기술(microfabrication process technology)로 제작되었으며, PDMS 채널은 마이크로공정 기술에 의해 제작된 50㎛ 높이를 가지는 몰딩 주형에 PDMS 전물질(prepolymer)를 부어 경화시키는 방식으로 제작하였다. 유기 기판과의 본딩은 접합 부분을 공기 플라즈마(plasma)를 처리하여 활성화 시킨 후 비가역적 접착을 하였다. 반응 용액은 시린지 펌프(KDS-100)으로 주입하였다.
이번 연구에서 제작된 칩은 낮은 측정한계로 적은 양의 샘플에 대하여 민감도 높은 신호를 신속히 측정할 수 있어 생화학적 연구에서의 항원항체 면역분석 및 심근경색이나 관상동맥질환 등의 의료용 임상 진단 소자로 사용될 수 있는 장점을 가지고 있으며, 측정방법이 전기화학적 측정으로 기존의 전자회로에 쉽게 통합될 수 있어 휴대용 진단기기에 응용될 수 있다고 전망된다.
