서지주요정보
Production of thymidine by metabolically engineered brevibacterium helvolum = Brevibacterium helvolum을 이용한 β-thymidine의 생산
서명 / 저자 Production of thymidine by metabolically engineered brevibacterium helvolum = Brevibacterium helvolum을 이용한 β-thymidine의 생산 / Hyeon-Cheol Lee.
저자명 Lee, Hyeon-Cheol ; 이현철
발행사항 [대전 : 한국과학기술원, 2003].
Online Access 원문보기 원문인쇄

소장정보

등록번호

8014637

소장위치/청구기호

학술문화관(문화관) 보존서고

DBS 03008

휴대폰 전송

도서상태

이용가능

대출가능

반납예정일

초록정보

Thymidine is a pyrimidine nucleoside that is used as an intermediate in the synthesis of azidothymidine, an active ingredient in a formulation for the treatment of AIDS. Thymidine is currently produced by a multi-step chemical reaction. A microbial fermentation process could be used to produce thymidine biologically, but many of the enzymes related to nucleotide biosynthesis are highly regulated. In order to overcome the complex regulation steps, an analogue mutant resistant to fluorouracil, hydroxyurea, and trimethoprim was constructed. The culture medium from a 16-hour flask culture of this mutant contained 382.7 mg/l of thymidine, in addition to several nucleosides, amino acids, and urea. However, the accumulation of thymidine monophosphate (TMP) inside the cells suggested a low activity level of TMP phosphohydrolase, which degrades TMP to produce thymidine. This limitation was overcome by cloning the TMP phosphohydrolase gene of the unusual bacteriophage SP8 into the pEKEx1 expression vector and expressing the enzyme in analogue mutants. Bacteriophage SP8, a phage whose genome contains hydroxymethyl uracil instead of thymine, productively infects B. subtilis strains and expresses TMP phosphohydrolase after infection. Novel TMP phosphohydrolase of SP8 was identified and cloned by using 2D-electrophoresis, MS/MS sequencing and in vitro transcription / translation. SP8 TMP phosphohydrolase is free of complex nucleotide regulation and has a high TMP hydrolysis activity. As results, the level of TMP in the transformant harboring pEKEx::TMPase was substantially decreased and thymidine was accumulated at 499.1 mg/l concentrations in the culture medium.

싸이미딘(thymidine)은 AIDS치료제의 구성성분으로 사용되는 azidothymidine의 전구물질로 사용 되는 피리미딘계의 핵산이다. 싸이미딘은 현재 고비용, 저효율의 다단계 화학합성에 의해 생산되고 있으며, 생물 공학적 시스템을 이용한 발효생산방법이 최근들어 연구되고 있다. 생물공학적 발효 생산 방법은 화학합성에 비해 간단한 공정을 거치며 고수율이기 때문에 생산 및 정제단계에서 많은 비용을 절감할 수 있다. 그러나 핵산 대사에 관여되는 효소들이 상당히 복잡한 조절 메카니즘에 의해 제어되고 있어 체계적인 대사의 이해가 필요하다. 본 연구에서는 싸이미딘을 생물공학적 방법에 의해 생산할 수 있는 미생물을 개발하였다. 우선 Brevibacterium균으로부터 싸이미딘이 싸이민(thymine)으로 분해되지 않는 deoA knockout 돌연변이 균주를 개발하였다. 이 균주로부터 싸이미딘 생합성대사에 관여하는 효소들을 fluorouracil, hydroxyurea, trimethoprim 과 같은 analogue에 내성을 갖도록 하여 효소의 조절을 없애고, 최종 산물인 싸이미딘 고농도 내성균을 선발하여 싸이미딘 생산균을 개발 하였다. 그러나 개발된 미생물은 과량의 TMP가 thymidine으로 전환되지 않고 세포내에 축적되는 현상을 관찰되었다. 이것은 세포내의 5’ nucleotidase의 활성이 낮기 때문에 일어나는 현상으로 이를 극복하기 위하여 자신의 게놈내에 싸이민 을 가지고 있지 않는 박테리오파지 SP8으로부터 피드백 저해를 받지 않는 새로운 TMP phosphohydrolase (TMPase)를 프로테오믹스 에서 응용되는 기술을 이용하여 클로닝하였고, 이 유전자를 싸이미딘 생산 돌연변이 균주에 도입하였다. 그 결과, TMPase를 도입하지 않은 균주에서는 약 380 mg/l 의 싸이미딘이 생산되었으나 세포내에 TMP가 축적되었고, TMPase를 도입한 균주에서는 약 500 mg/l 의 싸이미딘이 생산되었으며 TMP도 도입하지 않은 경우에 비해 1/10 수준으로 감소하였음을 알 수 있었다. 또한 TMPase의 발현은 thymidine의 생산은 증가시켰으나 세포의 성장을 저해시키는 영향을 주었음을 알 수 있었다.

서지기타정보

서지기타정보
청구기호 {DBS 03008
형태사항 xi, 81 p. : 삽도 ; 26 cm
언어 영어
일반주기 저자명의 한글표기 : 이현철
지도교수의 영문표기 : Jung-Hoe Kim
지도교수의 한글표기 : 김정회
학위논문 학위논문(박사) - 한국과학기술원 : 생물과학과,
서지주기 Reference : p. 71-78
주제 thymidine
recombinant Brevibacterium
SP8 TMP phosphohydrolase
싸이미딘
브레비박테리움
SP8 TMP 포스포하드롤라제
QR CODE qr code