Recombinant proteins can be synthesized in E. coli and guided to four different locations: the cytoplasm, the periplasmic space, the inner or outer membrane, and extracellular medium. Proteins found in the outer membrane or periplasmic space are synthesized in cytoplasm as premature (unprocessed) proteins. In E. coli, it has been established that protein secretion through the inner membrane to the periplasm or outer membrane is achieved by the signal peptide-dependent general secretion pathway (GSP) that is widespread as a universal secretion pathway. In this study, secretion and cell surface display system of proteins in E. coli for biotechnological application were developed.
Firstly, new secretion vectors containing the Bacillus sp. endoxylanase signal sequence were constructed for the secretory production of recombinant proteins in E coli. The E. coli alkaline phosphatase structural gene fused to the endoxylanase signal sequence was expressed from the trc promoter in various E. coli strains by inducing with IPTG. Among the tested, E. coli HB101 showed the highest efficiency of secretion (up to 25.3% of total proteins). When cells were induced with 1 mM IPTG, most of the secreted alkaline phosphatase formed inclusion bodies in the periplasm. However, alkaline phosphatase could be produced as a soluble form without reduction of expression level by inducing with less (0.01 mM) IPTG, and greater than 90% of alkaline phosphatase could be recovered from the periplasm by simple osmotic shock method. Fed-batch cultures were carried out to examine the possibility of secretory protein production at high cell density. Up to 5.2 g/L of soluble alkaline phosphatase could be produced in the periplasm by the pH-stat fed-batch cultivation of E. coli HB101 harboring pTrcS1PhoA. New artificial sequence was designed by analysis of Gram-negative bacterial signal sequences. The secretion efficiency could be improved by mutagenic PCR of artificial signal sequence
Secondly, a novel cell surface display system was developed using the Salmonella typhimurium outer membrane protein C (OmpC) as an anchoring motif. A C-terminal deletion-fusion strategy was employed to fuse the polyhistidine peptides, green fluorescent protein (GFP) and lipase to the C-terminal of the functional portion of OmpC. The polyhistidine peptides of up to 243 amino acids could be successfully displayed on the Escherichia coli cell surface, which allowed recombinant E. coli to adsorb up to 34.2 μmol of $Cd^{2+}$ per gram dry cell weight. The GFP and lipase could also be successfully displayed on the E. coli cell surface. The maximum unit of lipase on E. coli BL21(DE3) cell surface harboring placKSC-lip (unit per g-dry cell weight) was 1136 when induction concentration of IPTG was 100 μmol. Surface display of proteins or enzymes could be a powerful tool in bioconversion for the production of useful materials.
대장균에서 합성된 재조합 단백질은 세포질(cytoplasm)내, 주변세포질(periplasm), 세포 내막 혹은 외막, 세포질외부(extracellular)로 이동된다. 세포외막 혹은 주변세포질에서 발견되는 단백질들은 세포질 내에서 전단백질(premature protein) 형태로 합성된다. 대장균에서 세포 내막을 통과하여 세포질 혹은 세포외막으로 단백질을 이동시키는 분비는 일반적으로 널리 알려진 분비 신호 서열 의존형 일반 분비 경로(general secretion pathway)에 의해서 이루어 진다. 본 연구에서는 대장균에서 생물공학적 응용이 가능한 분비 및 세포 표면 발현 시스템을 개발하였다.
첫 번째로 대장균에서 재조합 단백질은 분비 생산하기 위하여 바실러스(Bacillus sp.)에서 유래한 엔도자일라나제(endoxylanase) 분비 신호 서열을 포함한 새로운 분비 발현 벡터를 제작하였다. 바실러스에서 유래한 분비 신호 서열에 융합된 대장균에서 유래한 알칼라인 포스파타제(alkaline phosphatase) 유전자를 trc 프로모터에 의해 다양한 대장균에서 발현시켰다. 다양한 대장균 중에서 대장균 HB101에서 가장 높은 분비 효율을 보였다(전체 단백질의 25.3%의 알칼라인 포스파타제). 대장균을 1mM의 IPTG 농도로 유도발현 시켰을 때, 대부분의 분비된 알칼라인 포스파타제는 세포질 내에서 불용성 응집체(inclusion body)를 형성하였다. 하지만, IPTG 농도를 0.01 mM로 낮추어 유도 발현시켰을 때에는 발현양의 감소 없이 생산된 알칼라인 포스파타제가 수용성 형태로 발현되었으며, 이때 간단한 삼투압 쇼크 방법(osmotic shock method)에 의해서 발현된 단백질의 90% 이상을 회수할 수 있었다. 고농도 배양에 의한 재조합 단백질의 분비 생산을 위해서 유가식 배양을 실시하였다. 재조합 플라스미드 pTrcS1PhoA에 의해 형질 전환된 대장균 HB101을 pH-stat 유가식 배양에 의하여 약 5.2 g/L의 수용성 알칼라인 포스파타제를 주변세포질에 생산할 수 있었다. 새로운 합성 분비 신호 서열을 그램 음성 박테리아에 존재하는 분비 신호서열을 분석하여 새롭게 디자인 하였다. 이 합성 분비 신호 서열의 분비 효율은 돌연변이유발 중합효소연쇄방법에 의하여 증진시킬 수 있었다.
두 번째로 살모넬라 티피무리움(Salmonella typhimurium)에서 유래한 세포외막 단백질 C (OmpC)를 세포표면 발현 모체(anchoring motif)로 사용하여 새로운 세포 표면 발현 시스템을 개발하였다. 폴리히스티딘 펩타이드(polyhistidine peptides), 녹색 형광 단백질(green fluorescent protein), 리파아제(lipase)를 세포외막단백질 C의 기능성 C-터미널에 융합시키기 위해 C-터미널 절단-융합 방법을 도입하였다. 243개의 아미노산으로 구성되는 폴리히스티딘 펩타이드를 대장균의 세포 표면에 성공적으로 발현시킬 수 있었으며, 이때, 대장균의 단위 세포 건조 중량 당 34.2 μmol의 카드늄을 흡착할 수 있었다. 녹색 형광 단백질과 리파아제 역시 대장균의 세포 표면에 성공적으로 발현시킬 수 있었다. 재조합 플라스미드 placKSC-lip에 의해 형질 전환된 재조합 대장균 BL21(DE3) 표면 위에 0.1mM 농도의 IPTG에 의해 유도 발현된 리파아제의 활성도는 단위 세포 건조 중량당 1136 unit 이었다. 단백질 혹은 효소의 세포 표면 발현은 유용한 물질을 만들기 위한 생물전환에 유용하게 이용될 수 있을 것이다.
